一种基于高灵敏GMR磁生物芯片的大肠杆菌检测方法

一种基于高灵敏gmr磁生物芯片的大肠杆菌检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于高灵敏gmr磁生物芯片的大肠杆菌检测方法，属于生物检测方法技术领域。


背景技术：

2.大肠杆菌是一种常居于人和各种动物肠道内的细菌，往往随粪便从体内排出，在自然界的散播十分广泛。人体感染了该大肠杆菌可引起各种疾病，如腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎、出血性肠炎和尿道炎等，严重者甚至死亡。
3.对大肠杆菌的快速、特异的检测对于早期病情的筛查、诊断、治疗、监测和有效的控制非常重要。目前，国内外现有的大肠杆菌检测方法主要有以下几类：传统检测方法、免疫学检测方法、分子生物学检测方法，传统的检测方法虽然灵敏度较高的，但是需要的时间较长，免疫学检测方法虽然具有一定的灵敏度但是目前还没有达到个位数高灵敏的检测能力，分子生物学方法虽然可以进行高灵敏的检测，但是需要的设备较为昂贵，而且需要专业的人员进行操作，无法满足便捷性的要求。
4.大肠杆菌的高灵敏快速检测难题和检测样本的信息长时间保存问题，首先大肠杆菌具有较强的致病性，高灵敏的快速检测则是提高对该细菌的防御性的关键技术，目前能够进行个位数量级的检测方法主要是传统的培养法以及核酸检测法，传统的培养法需要较长的时间，而核酸检测方法则需要昂贵的设备以及专业人员操作，这都无法满足高灵敏快速便捷的检测需求，其次目前基于生物传感器检测方法的大肠杆菌检测技术，存在检测信号不稳定，重复性差等问题，当样本检测完后基本上就失去了再次用于检测的可能，为了进一步提高大肠杆菌检测的可靠性和可复测性，所以需要解决样本信号的长时间保存问题。
5.随着交叉学科的发展，生物芯片技术应运而生，其具有的小型化，低功耗，高集成等优势使得生物芯片在癌症等疾病诊断、细菌病毒等生物目标检测具有巨大的应用潜力，而基于巨磁电阻效应的磁生物芯片是其中的一员，巨磁电阻效应（giant magnetoresistance：gmr）是金属材料在外磁场的作用下其电阻值发生变化的效应，基于该效应而制备的电子器件如磁存储，磁传感器等具有广泛的应用前景，gmr生物芯片主要利用基于巨磁电阻效应的gmr磁传感器与免疫磁珠技术结合而成，相对于其他的生物芯片技术（荧光，电化学等），基于磁电子的生物芯片具有背景噪声低，均一性好，能够较容易和微流控、ic电路进行集成等优势，使得gmr生物芯片非常适合于大肠杆菌的检测，而且基于磁珠的生物样本稳定性好，保存时间长，可以实现大肠杆菌的检测样本多次重复检测。
6.目前，虽然基于gmr生物传感器已经应用于大肠杆菌的检测（100 cfu/ml），但是检测灵敏度和其他生物传感器比如荧光传感器，电化学传感器（10 cfu/ml量级）等还有一定的差距，限制了gmr磁生物芯片在大肠杆菌的应用潜力，为了使得磁传感器芯片不仅可以解决大肠杆菌检测的样本信息保存问题，而且还具有较高的检测性能，所以需要开发新型的gmr生物芯片技术，目前的gmr生物芯片技术主要通过利用gmr传感器检测磁性标签的微弱杂散磁场获得生物检测功能，该方法受限于所使用的磁性标签所产生的杂散磁场较弱，无
法实现更高灵敏度的检测，所以需要开发新的检测方法，以获得更高的检测能力。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是：提供一种基于高灵敏gmr磁生物芯片的大肠杆菌检测方法，以解决上述现有技术中存在的问题。
8.本发明采取的技术方案为：一种基于高灵敏gmr磁生物芯片的大肠杆菌检测方法，包括以下步骤：s1，gmr生物芯片的准备，gmr生物芯片表面设置有sio2保护膜；s2，大肠杆菌在gmr生物芯片的上的捕获，包括以下步骤：s2.1，磁性靶向标签的制备，所选用的磁性标签为直径为1-2微米的磁珠；s2.2，大肠杆菌的磁性修饰；s2.3，gmr生物芯片表面功能化修饰，在gmr生物芯片表面sio2保护膜上，利用化学修饰的方法制备生物自组装膜，将二抗修饰在自组装膜表面，使得gmr生物芯片表面具有捕获大肠杆菌的能力；s2.4，大肠杆菌捕获；s3，gmr生物芯片的测试，大肠杆菌信息的读出。
9.优选的，所述步骤s1中，gmr磁生物芯片包括板状的衬底，衬底的上端面设置有gmr线条，衬底的上端面位于gmr线条两侧的位置分别设置有一个磁力线聚集器，两个磁力线聚集器之间磁化方向与gmr线条垂直；gmr线条尾部分别覆盖有一个电极，两个电极分别电性连接有电极引脚；sio2保护膜设置在衬底的上端面、gmr线条的上端面以及磁力线聚集器的上端面；电极包括电极底层和电极上层；衬底的上端面位于gmr线条周围的部分设置有生化反应槽，gmr线条以及电极均位于生化反应槽内部。
10.优选的，gmr线条为曲折型结构，线条的线宽为5
µ
m，长度为500
µ
m，间隙为15
µ
m。
11.优选的，磁力线聚集器为矩形的feni薄膜，厚度为2
µ
m。
12.优选的，电极底层为cr/cu电极层，厚度为10nm/150nm。
13.优选的，电极上层为au电极层，厚度为150nm。
14.优选的，sio2保护膜的厚度为20nm。
15.优选的，gmr生物芯片的制作步骤如下：步骤一：gmr线条图形化，在衬底表面进行线条图形化；步骤二：磁力线聚集器制作，在衬底表面进行磁力线聚集图形化；步骤三：电极底层制作，在衬底进行电极图形化，然后镀cr/cu电极层；步骤四：sio2保护膜制作，在衬底整个表面上加工sio2保护膜，然后进行电极图形化，刻蚀电极表面的sio2层，直到第一层电极露出；步骤五：电极上层制作 ，在衬底进行电极图形化，镀au电极层； 步骤六：生化反应槽制作，在衬底 表面的gmr检测区域制作生化反应槽，用于检测反应。
16.优选的，gmr线条利用离子束刻蚀工艺制作。
17.优选的，磁力线聚集器通过溅射工艺制备，并且利用liftoff工艺实现图形化。
18.优选的，电极底层通过溅射工艺制作，电极上层通过热蒸发工艺制作。
wafer)，衬底6的上端面设置有gmr线条1，衬底6的上端面位于gmr线条1两侧的位置分别设置有第一磁力线聚集器2a和第二磁力线聚集器2b，两个磁力线聚集器之间磁化方向与gmr线条1垂直；gmr线条1尾部分别覆盖有一个电极，两个电极分别电性连接有第一电极引脚4a和第二电极引脚4b；衬底6的上端面、gmr线条1的上端面、磁力线聚集器的上端面均设置有sio2保护膜3；电极包括电极底层和电极上层；衬底6的上端面位于gmr线条1周围的部分设置有生化反应槽5，gmr线条1以及电极均位于生化反应槽5内部。
29.其中，gmr线条1为曲折型结构，gmr线条1的线宽为5
µ
m，长度为500
µ
m，间隙为15
µ
m。
30.其中，磁力线聚集器为矩形的feni薄膜，厚度为2
µ
m。
31.其中，电极底层为cr/cu电极层，厚度为10nm/150nm。
32.其中，电极上层为au电极层，厚度为150nm。
33.其中，sio2保护膜3的厚度为20nm。
34.其中，gmr生物芯片12的制作步骤如下：步骤一：gmr线条1图形化，在衬底6表面进行gmr线条1图形化；步骤二：磁力线聚集器制作，在衬底6表面进行磁力线聚集图形化；步骤三：电极底层制作，在衬底6进行电极图形化，然后镀cr/cu电极层；步骤四：sio2保护膜3制作，在衬底6整个表面上加工sio2保护膜3，然后进行电极图形化，刻蚀电极表面的sio2层，直到第一层电极露出；步骤五：电极上层制作 ，在衬底6进行电极图形化，镀au电极层； 步骤六：生化反应槽5制作，在衬底6 表面的gmr检测区域制作生化反应槽5，用于检测反应。
35.其中，gmr线条1利用离子束刻蚀工艺制作。
36.其中，磁力线聚集器通过溅射工艺制备，并且利用liftoff工艺实现图形化。
37.其中，电极底层通过溅射工艺制作，电极上层通过热蒸发工艺制作。
38.其中，sio2保护膜3，通过pecvd工艺制作。
39.其中，生化反应槽5为su8工艺制作。
40.优选的，所述步骤s2中包括以下步骤：s2.1，磁性靶向标签9的制备，利用修饰有生物素的大肠杆菌抗体（一抗）7表面的生物素和修饰有亲和素的磁性标签8表面的亲和素进行特异性结合，制备大肠杆菌10的磁性靶向标签9；根据大肠杆菌10的尺寸：该菌大约长2μm，菌体直径为0.25~1μm，所选用的磁性标签为直径为1微米的磁珠；s2.2，大肠杆菌10的磁性修饰，利用磁性靶向标签9表面的一抗和大肠杆菌10进行抗原抗体特异性结合对大肠杆菌10进行磁性靶向标签9的修饰获得基于抗原抗体反应的修饰有磁性靶向标签的大肠杆菌11，本步骤使得大肠杆菌10的生物信息转化磁信息；s2.4，大肠杆菌10捕获，将基于抗原抗体反应的修饰有磁性靶向标签的大肠杆菌11滴加在gmr生物芯片12表面，通过抗原抗体反应，使得磁性标签标记的大肠杆菌10捕获在gmr生物芯片12表面，获得了利用抗原抗体反应捕获大肠杆菌后的gmr生物芯片15。
41.优选的，所述步骤s3中包括以下步骤：首先将没有发生生化反应的gmr生物芯片12固定在第一螺线管16a和第二螺线管16b之间的中间位置，然后接通gmr生物芯片12和检测电路，给gmr生物芯片12供给一定的工作电流，随后给第一螺线管16a和第二螺线管16b施加
电流，产生gmr区域的磁场16c，记录此刻的gmr生物芯片12输出的电压值，随后将发生过生化反应的gmr生物芯片12固定未发生反应的gmr生物芯片12的位置，然后接通gmr生物芯片12和检测电路，给gmr生物芯片12供给相同的工作电流，随后给第一螺线管16a和第二螺线管16b施加相同的电流，产生相同gmr区域的磁场16c，通过检测电路记录此刻的gmr生物芯片12输出的电压值；通过两个电压值的差值便可以获得检测的生物目标的信息。
42.本实施例中，大肠杆菌10在gmr生物芯片12表面的捕获主要有两个步骤，首先是将gmr生物芯片12进行表面的功能化修饰，将gmr生物芯片12的生化反应槽5中加入体积比为7：3的硫酸和双氧水的混合液中放置30min，用硫酸和双氧水的混合液清洗生化反应槽5表面并产生羟基，羟基的目的是为了固定3-氨丙基-3-乙氧基硅烷，然后用去离子水冲洗并吹干gmr生物芯片12。
43.再将gmr生物芯片12浸入10 mmol/l的 3-氨丙基-3-乙氧基硅烷乙醇溶液，反应30min，氨基硅烷化，结束后用乙醇漂洗gmr生物芯片12两次并吹干，将芯片放置于 100℃烘箱内45min。结束后将芯片浸入 10 mmol/l的对苯二甲醛丙酮溶液并静置30min，对苯二甲醛的一个醛基基团和氨基反应，另一个基团置于表面待反应，反应结束用去离子水冲洗芯片并吹干。
44.随后将浓度为50ul的0.5mg/ml的pbs缓冲液点在芯片表面，将芯片在 37℃ 恒温恒湿环境下放置4h固定大肠杆菌的捕获抗体(二抗)14。然后放置在 tween-20 pbs溶液和 pbs缓冲液中恒温(37℃)振荡各 5min，去除未固定的大肠杆菌的捕获抗体(二抗)14，然后向gmr生物芯片12反应槽滴入 1 mol /l三羟甲基氨基甲烷 (ph为7.4) 溶液中放置30 min，封闭3-氨丙基-3-乙氧基硅烷里面的其它的醛基基团，并用pbs缓冲液和去离子水进行清洗，除去没有固定在gmr生物芯片12表面的抗体，待用，完成了gmr生物芯片12的表面功能化。
45.利用等体积100ul的1mg/ml的修饰有生物素的大肠杆菌抗体(一抗)7和0.5mg/ml浓度的修饰有亲和素的磁性标签8(本实施例中的磁性标签为磁珠)进行室温混合30分钟获得通过亲和素和生物素特异性反应结合的修饰有大肠杆菌抗体(一抗)7的磁性靶向标签9，然后利用磁分离进行浓缩去除没有结合的修饰有生物素的大肠杆菌抗体(一抗)7，然后补充pbs使得通过亲和素和生物素特异性反应结合的修饰有大肠杆菌抗体(一抗)7的磁性靶向标签9溶液为100ul。
46.然后取10ul的通过亲和素和生物素特异性反应结合的修饰有大肠杆菌抗体(一抗)7的磁性靶向标签9溶液和1ml的浓度为10cfu/ml大肠杆菌10进行混合，并在37℃水浴条件下孵化20分钟，利用通过亲和素和生物素特异性反应结合的修饰有大肠杆菌抗体(一抗)7的磁性靶向标签9表面的一抗和大肠杆菌10进行抗原抗体特异性结合，对大肠杆菌10进行过饱和磁性修饰，并利用磁铁进行浓缩最后获得20ul的浓缩的基于抗原抗体反应的修饰有磁性靶向标签的大肠杆菌11，将基于抗原抗体反应的修饰有磁性靶向标签的大肠杆菌11滴加在gmr生物芯片12的生物反应槽中，利用芯片表面的大肠杆菌的捕获抗体(二抗)14和基于抗原抗体反应的修饰有磁性靶向标签的大肠杆菌11进行特异性反应，在37℃水浴孵化20分钟，然后用pbs清洗三次，获得利用抗原抗体反应(大肠杆菌10和二抗的特异性结合)捕获大肠杆菌后的gmr生物芯片15，随后进行下一步的检测。
47.本实施例中利用抗原抗体反应(大肠杆菌10和二抗的特异性结合)捕获大肠杆菌
后的gmr生物芯片15测试的实现，主要利用第一螺线管16a和第二螺线管16b产生外部的gmr区域的磁场16c对gmr生物芯片12进行激励，并且对捕获在gmr生物芯片12表面的修饰有亲和素的磁性标签8进行磁化，修饰有亲和素的磁性标签8在激励磁场的磁化下会分流gmr区域的磁场16c，使得磁性标签的区域具有比gmr区域的磁场16c更强的磁珠分流的磁场17，这个分流会影响激励磁场对gmr生物芯片12的作用，通过测量仪器数字源表等进行数据的读出，便可以获得修饰有亲和素的磁性标签8的数量，通过修饰有亲和素的磁性标签8的数量便可以得到大肠杆菌10的数量，从而实现对大肠杆菌10的检测。
48.本发明中，gmr生物芯片12测试的实现，利用外磁场对gmr生物芯片12和捕获的免疫磁场进行磁化，免疫磁珠是一种超顺磁性磁珠，在外磁场的作用下会对gmr区域的磁场16c进行聚集形成更强的磁珠分流的磁场17，实现了对gmr区域的磁场16c的分流，这个分流的变化，会带来基于gmr磁电子的gmr生物芯片12的电阻变化，通过通过测试仪器18检测检测电阻的变化，便可以获得待检测的免疫磁珠的数量，通过免疫磁珠的数量便可以得到生物目标的数量，从而实现对生物目标的检测。
49.图4中为本发明与传统方法的检测性能对比，横坐标表示的细菌浓度(本测试中使用的均为1ml)，纵坐标表示的是gmr输出信号（gmr的变化率mr来表示）。
50.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。