利用磁性纳米固定化酶将S腺苷甲硫氨酸转化合成ACC方法与流程

后，选取生长状况较好的幼苗碾压使其下胚轴尾部稍微破损，冷藏15-26h，作为酶提取材料。
8.在上述的利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法中，作为优选的方案，所述步骤二具体为：以ph 8.0的磷酸缓冲液并添加质量分数为0.01-0.05%的二硫苏糖醇和质量分数为0.0001-0.0005%磷酸吡哆醛作为提取液，料液比1:5-15，用打浆机粉碎幼苗，粉碎时间1-3min，然后放入超声提取器中提取2-5min；将提取液用5-6层纱布过滤，即可得到提取液。
9.在上述的利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法中，作为优选的方案，所述步骤三具体为：向步骤二中的提取液中加入质量分数20%-30%的硫酸铵，充分溶解后放入4℃保藏50-90min，离心萃取器以5000-8000转/min离心15-20min，取上清液；上清液以截留分子量3kda的超滤膜超滤，取截留溶液再用10kda的超滤膜超滤，截留溶液即为1-氨基环丙烷羧酸合成酶酶液。
10.在上述的利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法中，作为优选的方案，所述步骤四具体为：取50-100g apts-fe4o3磁性纳米颗粒分散在1-5 l质量分数10-20%戊二醛（ga）水溶液中并搅拌 2-5h，加入磁铁吸取磁性纳米颗粒；将制备好的apts-fe4o
3-ga纳米粒子均匀分散在1-5 l上述酶液中，在20-30℃和100-200 rpm 下搅拌 3-6 h，得到固定化酶用磷酸缓冲液洗涤数次，其中，磷酸缓冲液ph=8.0，将其储存在上述缓冲液中，即可得到1-氨基环丙烷羧酸合成磁性纳米固定化酶。
11.在上述的利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法中，作为优选的方案，所述磷酸缓冲液为磷酸钠缓冲液或者磷酸钾缓冲液。
12.在上述的利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法中，作为优选的方案，所述步骤五具体为：用ph 8.0的磷酸缓冲液配置质量分数1%-10%的s-腺苷甲硫氨酸溶液100-500 l，并向其中添加20-60 g的二硫苏糖醇、1-5g的磷酸吡哆醛和10-50g的磁性纳米颗粒固定化酶，充分密封混合后，置于20-30 ℃恒温反应釜中搅拌反应3-6 h；然后，向反应釜底部加入磁铁吸附磁性纳米颗粒固定化酶，取出反应液，再加入新的反应液；连续循环反应5-20次，合并反应液即为1-氨基环丙烷羧酸粗品。
13.本发明提供一种利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法，具有如下有益效果：本发明通过特定方法从植物黄化苗中提取制备1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶，并通过交联法制备磁性纳米固定化酶。该固定化酶稳定性强，催化活性高。并且容易通过外加磁场快速从反应液中分离出来，循环使用，节省成本。
14.本发明通过提出的利用固定化1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶连续循环合成1-氨基环丙烷-1-羧酸的方法，便于放大，可大规模生产制备1-氨基环丙烷-1-羧酸。
15.本发明提出的利用固定化1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶连续循环合成1-氨基环丙烷-1-羧酸的方法，在温和条件下反应，能耗低，不使用有机试剂和重金属，环境友好。
附图说明
16.图1为本发明的1-氨基环丙烷羧酸合成磁性纳米固定化酶扫描电镜图；图2为本发明的acc标准品hplc色谱图；
图3为本发明的纯化产物hplc色谱图；图4为本发明的acc纯品1h-nmr谱图；图5为本发明的acc纯品
13
c-nmr谱图。
具体实施方式
17.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.以下结合具体情况说明本发明的示例性实施例：实施例1如图1-图5所示，本发明提供一种利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法，包括：步骤一、将丝瓜、番茄、大豆、玉米种子中的至少任意一种在一定条件下培育，获得黄化苗；具体为：取1kg丝瓜、番茄、大豆或玉米种子中的一种，用蒸馏水洗净后浸泡24h置于湿润的纱布上，于 25℃培养箱中萌发；每天用蒸馏水洗涤幼苗一次，萌发6d 后，选取生长状况较好的幼苗碾压使其下胚轴尾部稍微破损，冷藏15-26h，作为酶提取材料。步骤二：从黄化苗中提取1-氨基环丙烷羧酸合成酶（acs）溶液；具体为：以ph 8.0的磷酸缓冲液并添加质量分数为0.01-0.05%的二硫苏糖醇和质量分数为0.0001-0.0005%磷酸吡哆醛作为提取液，料液比1:5-15，用打浆机粉碎幼苗，粉碎时间1-3min，然后放入超声提取器中提取2-5min；将提取液用5-6层纱布过滤，即可得到提取液。
19.步骤三：利用步骤二中的提取液通过硫酸铵盐析法和超滤法获得高纯度1-氨基环丙烷羧酸合成酶（acs）；具体为：向步骤二中的提取液中加入质量分数20%-30%的硫酸铵，充分溶解后放入4℃保藏50 min，离心萃取器以6000 r/min离心15-20min，取上清液；上清液以截留分子量3 kda的超滤膜超滤，取截留溶液再用10 kda的超滤膜超滤，截留溶液即为1-氨基环丙烷羧酸合成酶酶液。
20.步骤四：将高纯度1-氨基环丙烷羧酸合成酶（acs）通过戊二醛交联法获得磁性纳米固定化1-氨基环丙烷羧酸合成酶；具体为：取50-100g apts-fe4o3磁性纳米颗粒分散在1-5 l质量分数10-20%戊二醛（ga）水溶液中并搅拌 2-5h，加入磁铁吸取磁性纳米颗粒；将制备好的apts-fe4o
3-ga纳米粒子均匀分散在1-5 l上述酶液中，在20-30℃和100-200 rpm 下搅拌 3-6 h，得到固定化酶用磷酸缓冲液洗涤数次，其中，磷酸缓冲液ph=8.0，将其储存在上述缓冲液中，即可得到1-氨基环丙烷羧酸合成磁性纳米固定化酶。所述磷酸缓冲液为磷酸钠缓冲液或者磷酸钾缓冲液。
21.步骤五：利用磁性纳米固定化1-氨基环丙烷羧酸合成酶在辅酶溶液系统中将s-腺苷甲硫氨酸连续循环生物转化合成1-氨基环丙烷羧酸。具体为：用ph 8.0的磷酸缓冲液配置质量分数1%-10%的s-腺苷甲硫氨酸溶液100-500 l，并向其中添加20-60 g的二硫苏糖醇、1-5g的磷酸吡哆醛和10-50g的磁性纳米颗粒固定化酶，充分密封混合后，置于20-30 ℃恒温反应釜中搅拌反应3-6 h；然后，向反应釜底部加入磁铁吸附磁性纳米颗粒固定化酶，取出反应液，再加入新的反应液；连续循环反应5-20次，合并反应液即为1-氨基环丙烷羧酸粗品。
22.实施例2一、黄化苗培养取1kg黄豆用蒸馏水洗净后浸泡24h置于湿润的纱布上，于 25℃培养箱中萌发。每天用蒸馏水洗涤幼苗一次，萌发6d 后，选取生长状况较好的幼苗碾压使其下胚轴尾部稍微破损，冷藏15h，作为酶提取材料。
23.二、1-氨基环丙烷羧酸合成酶提取以ph 8.0的磷酸缓冲液并添加质量分数0.01%的二硫苏糖醇和0.0001%磷酸吡哆醛作为提取液，料液比1:5，用打浆机粉碎幼苗，粉碎时间1min，然后放入超声提取器中提取2min。将提取液用5层纱布过滤，即可得到提取液。
24.三、1-氨基环丙烷羧酸合成酶纯化向上述提取液中加入质量分数20%的硫酸铵，充分溶解后放入4℃保藏50min，以5000转/min离心15，取上清液。上清液以截留分子量3kda的超滤膜超滤，取截留溶液再用60kda的超滤膜超滤，截留溶液即为1-氨基环丙烷羧酸合成酶酶液。
25.四、1-氨基环丙烷羧酸合成酶固定化取50g apts-fe4o3磁性纳米颗粒分散在1 l质量分数10%戊二醛（ga）水溶液中并搅拌 2h，加入磁铁吸取磁性纳米颗粒。将制备好的apts-fe4o
3-ga纳米粒子均匀分散在1 l上述酶液中，在20℃和100-200 rpm 下搅拌 3 h，得到固定化酶用磷酸缓冲液（ph=8.0）洗涤数次，将其储存在上述缓冲液中，即可得到1-氨基环丙烷羧酸合成磁性纳米固定化酶。
26.五、固定化酶循环生物转化合成1-氨基环丙烷羧酸工艺用ph 8.0的磷酸缓冲液配置质量分数1%的s-腺苷甲硫氨酸溶液100 l，并向其中添加20 g的二硫苏糖醇、1g的磷酸吡哆醛和10g的磁性纳米颗粒固定化酶，充分密封混合后，置于20 ℃恒温反应釜中搅拌反应3 h。然后，在反应釜底部加入磁铁吸附磁性纳米颗粒固定化酶，取出反应液，再加入新的反应液。如此，连续循环反应10次。合并反应液即为1-氨基环丙烷羧酸粗品。
27.实施例31.黄化苗培养取1kg丝瓜种子用蒸馏水洗净后浸泡24h置于湿润的纱布上，于 25℃培养箱中萌发。每天用蒸馏水洗涤幼苗一次，萌发6d 后，选取生长状况较好的幼苗碾压使其下胚轴尾部稍微破损，冷藏9h，作为酶提取材料。
28.2.1-氨基环丙烷羧酸合成酶提取以ph 8.0的磷酸缓冲液并添加质量分数0.01%的二硫苏糖醇和0.0001%磷酸吡哆醛作为提取液，料液比1:8，用打浆机粉碎幼苗，粉碎时间1-3min，然后放入超声提取器中提取2min。将提取液用5层纱布过滤，即可得到提取液。
29.3.1-氨基环丙烷羧酸合成酶纯化 向上述提取液中加入质量分数20%-30%的硫酸铵，充分溶解后放入4℃保藏50min，以5000转/min离心15-20min，取上清液。上清液以截留分子量3kda的超滤膜超滤，取截留溶液再用10kda的超滤膜超滤，截留溶液即为1-氨基环丙烷羧酸合成酶酶液。
30.4.1-氨基环丙烷羧酸合成酶固定化取50-100g apts-fe4o3磁性纳米颗粒分散在1-5 l质量分数10-20%戊二醛（ga）水
ml/min,检测波长260nm，进样量100 uml。目标物出峰时间13.676 min，收集流份，并冷冻干燥，得到199mg白色粉末物质。
38.产品检测（1）hplc法检测取上述分离纯化产物1 mg用1ml超纯水溶解，0.45um微孔滤膜过滤，进行hplc法检测。色谱柱为沃特世atlantis dc18 column, 100
å
, 5
ꢀµ
m, 4.6 mm x 150 mm，流动相1%甲醇-水（含0.1%甲酸，v/v），流速0.5 ml/min,检测波长260nm，进样量10 uml。
39.（2）核磁共振法检测取上述分离纯化产物15 mg用0.5 mldmso-d6溶解，进行1h-nmr、
13
c-nmr检测。分析说明：通过对产品进行检测分析，结果如图-2、图-3、图-4、图-5所示，数据与文献报道一致，可以说明本发明所得产品为1-氨基环丙烷羧酸。
40.反应转化率通过上述hplc法检测反应液中产物1-氨基环丙烷羧酸，计算反应产率。
41.（参照下表）序号转化率实例279.2%实例379.3%实例479.2%实例579.1%
42.最后，还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
43.以上应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。