结核分枝杆菌抗原组合物EPDPA015及其制备方法与应用与流程

本发明涉及基因工程，尤其涉及结核分枝杆菌抗原组合物epdpa015及其制备方法与应用。

背景技术：

1、结核病是由结核分枝杆菌引起的，卡介苗(bcg)作为目前为止唯一获准用于预防结核病的疫苗，在反复传代和保存中一些保护性抗原不同程度丢失、导致其免疫保护效果减弱，且对成年人保护效果不佳，因此研制新型预防和治疗性结核疫苗势在必行。

2、机体的抗结核免疫反应主要为致敏t细胞介导的细胞免疫，抗原特异性cd4+、cd8+t细胞在机体抗结核感染中起着关键作用，因此寻找特异性抗原成分是新型亚单位疫苗设计的关键。目前在研疫苗中，亚单位蛋白疫苗仅需一种或几种保护性抗原即可刺激产生有效的免疫反应，避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副反应和疫苗引起的相关疾病，因此具有很好的应用开发前景。目前已发现多种免疫优势抗原，主要为分泌蛋白、细胞壁蛋白和菌体裂解释放出的胞浆蛋白，一些能够诱导细胞免疫或体液免疫的蛋白抗原被广泛应用于结核病诊断、治疗及新型疫苗的研制。

3、目前，进入临床试验阶段的结核病疫苗，包括重组卡介苗、全菌灭活疫苗、dna疫苗、蛋白/多肽疫苗和病毒载体疫苗等。其中全菌灭活疫苗成分复杂，大剂量接种才可发挥有效的免疫应答，且易出现不良反应；减毒活疫苗不适用于儿童和免疫低下的人群；dna疫苗和重组卡介苗安全性存在一定争议，而病毒载体疫苗缺点在于机体既存的免疫应答会阻止该免疫抗原发挥效应，从而减弱疫苗功效；另外，机体对活载体的免疫反应限制了再次免疫的效果。

技术实现思路

1、卡介苗(bcg)是目前世界上接种最为广泛的结核疫苗，能够有效预防新生儿脑膜结核以及全身粟粒性结核，但对成年人预防效果有限且不适用于免疫缺陷患者。而蛋白亚单位疫苗具有保护性抗原表位多，安全性高等优势。

2、本发明基于生物信息学分析，对rv1196(ppe18)、rv0350(dnak)和rv0934(psts1)基因及其产物进行预测、设计和优化，构建可高效表达潜在t细胞表位聚集簇的基因片段，形成nrv1196、nrv0350和nrv0934，通过基因工程技术体外表达蛋白nppe18、ndnak和npsts1。最后，本发明选用esxh、nppe18、ndnak、npsts1以及ag85b作为构建epdpa015亚单位疫苗的潜在候选组分。

3、第一方面，本发明提供一种结核分枝杆菌抗原组合物，由esxh、nppe18、ndnak、npsts1和ag85b组成。

4、esxh可诱导强的cd4+t细胞应答和高水平ifn-γ分泌。ag85b可刺激机体产生th1型细胞因子，诱导增强bcg疫苗的免疫保护效。ppe蛋白家族中的ppe18可介导病原体-宿主的相互作用，是分枝杆菌在细胞内存活的关键毒力因子。分子伴侣蛋白dnak能诱导人外周血单个核细胞(pbmc)分泌tnf-α和il-10等保护性细胞因子。而磷酸盐特异性运输底物结合蛋白-1(psts1p)是rv0934基因编码的一种参与无机磷酸盐跨膜转运的细胞壁蛋白，可诱导小鼠cd8+t细胞的激活并产生th1和th17免疫保护反应。

5、第二方面，本发明提供一种结核分枝杆菌混合蛋白抗原epdpa015m，包含rv0288、nrv1196、nrv0350、nrv0934以及rv1886c五种基因片段的表达产物。

6、在本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原epdpa015m中，所述rv0288的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述nrv1196的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述nrv0350的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述nrv0934的核苷酸序列如seq idno.4所示，所述rv1886c的核苷酸序列如seq id no.5所示。

7、本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原epdpa015m，由独立表达的抗原esxh、nppe18、ndnak、npsts1和ag85b构成混合抗原epdpa015m；以摩尔比计，含有相同摩尔量的抗原esxh、nppe18、ndnak、npsts1和ag85b。

8、本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原epdpa015m，所述esxh的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述nppe18的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述ndnak的氨基酸序列如seq id no.8所示，所述npsts1的氨基酸序列如seq id no.9所示，所述ag85b的氨基酸序列如seq id no.10所示。

9、第三方面，本发明请求保护一种dna片段，所述dna片段为编码抗原nppe18的nrv1196，所述nrv1196的核苷酸序列如seq id no.2所示；

10、或，所述dna片段为编码抗原ndnak的nrv0350，所述nrv0350的核苷酸序列如seqid no.3所示；

11、或dna片段为编码抗原npsts1的nrv0934，所述nrv0934的核苷酸序列如seqidno.4所示。

12、本发明对现有技术中，编码结核分枝杆菌ppe家族蛋白nppe18、分子伴侣蛋白ndnak、的基因片段进行选择和优化。最终得到核苷酸序列如seq id no.2和3所示，比起已有的dna片段，本发明提供的seq id no.2和3优势在于：本发明利用生物信息学软件对蛋白抗原进行表位分析和预测，根据分析预测结果，选择能与mhc分子结合，又能与tcr结合的表位多肽，经过剪接，删除免疫原性相对较弱的冗余片段，形成抗原表位集中区，增强抗原免疫原性。

13、结核亚单位疫苗抗原选择的最佳策略是联合结核分枝杆菌不同感染阶段的优势抗原以期提高疫苗保护效力。目前尚有许多未被应用于结核疫苗开发但已被证明免疫原性良好的抗原，如psts1、dnak等具有成为疫苗候选抗原的潜力。因此，基于多阶段抗原联合效果优于单一抗原的疫苗制备思路，本发明选用esxh、ppe18和ag85b等生长期抗原、dnak等潜伏期抗原以及各时期稳定表达的psts1等五种抗原制备多阶段疫苗。

14、此外，机体免疫细胞发挥免疫效应是通过识别并结合抗原表位而非整个抗原分子，而上述m72、h4、h56:ic31、aec/bc02等候选疫苗均采用完整抗原分子作为组分，但本发明在选择具有良好免疫原性的完整优势抗原分子基础上，依据生物信息学软件预测抗原表位，剪切冗余片段，提高了免疫针对性。

15、第四方面，本发明提供一种融合蛋白抗原epdpa015f，所述融合蛋白抗原epdpa015f的核苷酸序列从n端到c端按照rv0288、nrv1196、nrv0350、nrv0934以及rv1886c，通过linker连接得到联合基因。

16、本发明所提供的融合蛋白抗原epdpa015f，所述联合基因的核苷酸序列如seqidno.11所示，所述联合基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.12所示。

17、第五方面，本发明提供上述的结核分枝杆菌抗原组合物或上述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原epdpa015m或上述的融合蛋白抗原epdpa015f在以下任一方面的应用：

18、(1)制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂；

19、(2)制备预防结核分枝杆菌感染疫苗；

20、(3)制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物。

21、本发明的有益效果：

22、本发明构建epdpa015m和epdpa015f联合氢氧化铝佐剂的两种新型亚单位疫苗免疫balb/c小鼠，以bcg作为阳性对照，以pbs与佐剂作为阴性对照，评价和分析epdpa015m和epdpa015f的免疫学效果。epdpa015m组和epdpa015f组的体液免疫特异性抗体igg水平均显著高于bcg组，表明与bcg相比，epdpa015m和epdpa015f用于制备亚单位疫苗均可产生较强的体液免疫，且igg2a/igg1结果显示两种蛋白均倾向诱导th2型免疫反应。epdpa015f/佐剂诱导产生的ifn-γ、tnf-α、il-12、il-10和il-17四种抗原特异性细胞因子显著高于bcg对照组，其中il-12可促进th0向th1分化，增加ifn-γ、tnf-α分泌从而扩大th1应答效应；而由cd4+th2细胞分泌产生的il-10可辅助体液免疫，il-17可募集、活化中性粒细胞和单核细胞，诱导局部炎症反应，提示epdpa015f/佐剂可刺激多种细胞参与机体免疫应答。epdpa015m/佐剂诱导产生的il-12水平高于bcg对照组，表明epdpa015m蛋白作为亚单位疫苗也可诱导产生比bcg更全面的免疫保护反应。体外分枝杆菌抑制实验表明，亚单位疫苗epdpa015m/佐剂和epdpa015f/佐剂均表现出比bcg更强的抑制分枝杆菌生长能力。因此，本发明的抗原组合物epdpa015整体上表现出较优的免疫原性和保护效应，能引起机体产生较强的抗原特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，具有作为独立疫苗或卡介苗加强型疫苗的潜力。

23、本发明选择多组分蛋白构建亚单位疫苗，克服了单一抗原组分有效抗原表位不足的问题；同时选择表位聚集区的序列nppe18、ndnak、npsts1而非抗原全长作为多组分抗原成分，有效提高了免疫针对性，能够刺激机体产生与全抗原相当甚至更强的免疫反应。本发明不仅选择结核生长期抗原esxh、ag85b作为组分，还选择结核潜伏期优势抗原dnak和分枝杆菌细胞壁优势抗原psts1的表位聚集区作为抗原组分，克服了抗原类型单一的问题，也为后续抗结核疫苗的研制提供了新的思路。

24、总的来说，本发明提供的结核分枝杆菌抗原组合物epdpa015作为结核病新型疫苗候选抗原兼备了制备方法简单易行，适合大规模生产，且成本较低等优势。因此，基于本发明的抗原组合物epdpa015制成的亚单位疫苗有望成为新型结核疫苗候选。