无乙醇洗脱方法及其在建库测序中的应用与流程

1.本技术涉及基因测序技术领域，具体涉及一种无乙醇洗脱方法及其在建库测序中的应用。


背景技术：

2.目前，随着测序技术的发展，基因测序成为生命科学研究中的重要手段。同时，随着测序通量的不断提升以及应用场景的不断扩大，对高通量、自动化的建库技术的需求量日益增加。
3.相关技术中，建库一般包括核酸片段化、末端修复、接头连接、pcr扩增、环化和消化等步骤，其中普遍使用磁珠对各个步骤的产物进行纯化，如对片段化产物、接头连接产物、pcr扩增产物和消化产物等进行纯化，这些纯化步骤中的每一次纯化都需要使用乙醇对磁珠与待纯化产物的结合物进行多次洗涤，以确保纯化效果。然而，多次的乙醇洗涤增加了建库总时长，并且乙醇的添加和洗涤均需要用户手工进行操作，导致实验操作复杂、费时费力，且无法实现“全程自动化，无手工处理”的要求。
4.由此，亟待开发一种步骤简单、无需手工操作的流程化高效建库方法。


技术实现要素：

5.本技术至少从以下方面解决了相关技术的问题之一。
6.为此，本技术第一方面实施例提供了一种无乙醇洗脱的方法，包括：提供磁珠-待洗脱样品的结合物；和将洗脱液与所述结合物接触，以洗脱所述样品，其中，所述洗脱中不使用乙醇。
7.在一些实施例中，所述样品为核酸或蛋白。在一些实施例中，所述样品为dna和/或rna。
8.在一些实施例中，所述洗脱液选自单蒸水、双蒸水、无核酶水(nf-free water)、tris-hcl缓冲液、te缓冲液、ae缓冲液或其组合。
9.本技术第二方面实施例还提供了一种无乙醇建库的方法，包括：使用如上述第一方面任一实施例所述的无乙醇洗脱的方法进行以下中的至少一个：样品片段化产物纯化、接头连接产物纯化、pcr产物纯化和消化产物纯化。
10.在一些实施例中，所述样品片段化产物纯化具体包括：将所述样品片段化，以获得样品片段化产物；将磁珠与所述样品片段化产物接触，以获得磁珠-样品片段化产物；和使用洗脱液将所述样品片段化产物洗脱，以获得纯化后的样品片段化产物，其中，所述洗脱中不使用乙醇。
11.在一些实施例中，使用酶切和/或超声将所述样品片段化。
12.在一些实施例中，所述无乙醇建库的方法还包括：将所述样品片段化，以获得样品片段化产物；将磁珠与所述样品片段化产物接触，以筛选出具有期望片段长度的样品片段化产物，其中所述具有期望片段长度的样品片段化产物与所述磁珠特异性结合；和使用洗
脱液将所述具有期望片段长度的样品片段化产物从所述磁珠上洗脱，以获得筛选后的样品片段化产物，其中，所述洗脱中不使用乙醇。
13.在一些实施例中，使用酶切和/或超声将所述样品片段化。
14.在一些实施例中，所述期望片段长度为100-700bp。在一些实施例中，所述期望片段长度为250-375bp。在一些实施例中，所述期望片段长度为300-350bp。在一些实施例中，所述期望片段长度为350bp。
15.在一些实施例中，在所述接头连接后、所述接头连接产物纯化前，所述无乙醇建库的方法还包括：向所述接头连接产物中加入稀释液。
16.在一些实施例中，所述稀释液选自单蒸水、双蒸水、无核酶水、tris-hcl缓冲液、te缓冲液、ae缓冲液或其组合。
17.在一些实施例中，所述接头连接产物纯化包括两次基于磁珠-接头连接产物结合物的洗脱。
18.在一些实施例中，所述无乙醇建库的方法还包括环化，其中在所述环化后、所述消化产物纯化前，所述方法还包括：使用消化酶处理所述环化产物以获得所述消化产物。在一些实施例中，所述消化酶为核酸外切酶iii。
19.本技术第三方面实施例提出了如上述第一方面任一实施例所述的无乙醇洗脱的方法或如上述第二方面任一实施例所述的无乙醇建库的方法在测序中的应用。
20.本技术第四方面实施例提出了一种自动化无乙醇建库试剂盒，包括：建库试剂板；接头试剂板；和磁珠试剂板，其中，所述建库试剂板包含建库试剂，所述建库试剂包含：样品片段化试剂、接头连接试剂、pcr反应试剂。
21.在一些实施例中，所述建库试剂板还包含环化试剂和消化试剂。
22.在一些实施例中，所述接头试剂板包含接头；所述磁珠试剂板包含磁珠、洗脱液和可选地稀释液，并且其中所述磁珠试剂板中不包含乙醇。
23.本技术的实施例实现了如下有益效果：
24.本技术实施例中提出的无乙醇洗脱方法以及建库方法，在各个基于磁珠进行的纯化步骤中省去了乙醇洗涤的步骤，有效减少了操作时间并简化了操作步骤，并且能够保证建库质量和后续测序的数据稳定性。进一步地，基于本技术实施例中的无乙醇建库方法提出的建库试剂盒，在使用过程中各个步骤的纯化也无需人工添加乙醇进行洗涤，因此实现了流程的全自动化，并大大简化了实验步骤，有效节约了人力和时间成本。
附图说明
25.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为根据本技术实施例的无乙醇洗脱方法的示意图；
27.图2为根据本技术实施例的无乙醇建库方法示意图；
28.图3为根据本技术实施例的自动化无乙醇建库试剂盒的展示图。
具体实施方式
29.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，并非限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
30.本技术是基于发明人的以下认识做出的：
31.在相关技术中，利用磁珠进行样品纯化的方案一般为：(1)在样品中加入磁珠结合液，该磁珠结合液中包含结合buffer以及磁珠；(2)使样品和磁珠结合液进行一定时间的充分接触，以基于与磁珠的结合进行样品纯化；(3)将结合后的混合液置于磁力装置中，待固体的磁珠在磁力的作用下与液体分离后丢弃液体；(4)在磁珠中加入新鲜乙醇溶液以洗涤磁珠；(5)将洗涤后的体系置于磁力装置中，待固体的磁珠在磁力的作用下与液体分离后丢弃液体；(6)重复一次步骤(4)和步骤(5)；(7)在磁珠中加入洗脱液；(8)待样品和洗脱液进行充分结合；(9)取出含纯化后样品的洗脱液。
32.然而，在上述纯化过程中，需要使用乙醇对磁珠进行多次洗涤，由此增加了实验操作时长；而洗涤磁珠往往要求使用新鲜乙醇溶液，即在使用前基于无水乙醇等高浓度乙醇实时配置75-80％的相对低浓度的乙醇溶液(现用现配)，由此更加增加了实验的繁琐性。此外，乙醇的添加和洗涤步骤均需要用户手动操作，既耗费时间和人力成本，也无法实现全自动化操作。
33.进一步地，上述利用磁珠的纯化在相关的建库流程中应用广泛。然而，同样，建库过程中多次乙醇的洗涤等使得建库流程时间长、步骤繁琐且无法实现全自动化。
34.本技术实施例提供一种无乙醇洗脱方法，该方法无需引入乙醇洗涤步骤，并仍能够实现样品纯化并保证样品纯化的效果。具体到建库流程，利用该方法进行各个步骤的纯化后，能够保证建库质量和后续测序的数据稳定性，因而有效减少了操作时间并大大简化了操作步骤。
35.此外，基于本技术实施例提出的无乙醇洗脱方法，本技术实施例提出了一种建库试剂盒，其在使用过程中各个步骤的纯化也无需人工添加乙醇进行洗涤，因此实现了流程的全自动化，并大大简化了实验步骤，有效节约了人力和时间成本。
36.图1为根据本技术实施例的无乙醇洗脱方法的示意图。如图1所示，本技术实施例第一方面提出的无乙醇洗脱的方法，包括：提供磁珠-待洗脱样品的结合物；和将洗脱液与结合物接触，以洗脱样品，其中，洗脱中不使用乙醇。
37.在本技术实施例中，术语“洗脱”是指基于洗脱液，将与磁珠结合的样品溶于洗脱液中，以此实现样品与磁珠的分离，即将样品从磁珠上洗脱下来。可以理解的是，在本技术实施例中，磁珠作为纯化工具，在加入待纯化样品的体系后，可以与体系中符合筛选条件的样品特异结合，而不与不符合筛选条件的样品结合，由此通过与磁珠的特异性筛选结合，实现样品纯化的作用，进而通过洗脱步骤，将与磁珠结合的筛选出的样品从磁珠上洗脱下来并溶于洗脱液中，以此获得纯化后的样品。
38.在本技术实施例中，“样品”可以为核酸或蛋白。在一些实施例中，样品可以为dna和/或rna。相应地，在本技术实施例中，“磁珠”可以为特异性捕获所述样品的各类磁珠，例如可以为特异性捕获核酸或蛋白的磁珠。在一些实施例中，磁珠可以为特异性捕获dna和/或rna的磁珠。可以理解的是，能够实现相应样品筛选需求的磁珠均可以用于本技术实施例
中的筛选或纯化步骤，本技术无意对磁珠的选择进行限制。
39.在本技术实施例中，“磁珠结合液”可以为任意市售的或可用于样品纯化的磁珠试剂，其中该磁珠结合液中包含磁珠以及提供结合背景条件的结合buffer。
40.在本技术实施例中，洗脱液可以选自单蒸水、双蒸水、无核酶水(nf-free water)、tris-hcl缓冲液、te缓冲液、ae缓冲液或其组合。可以理解的是，经由洗脱液，与磁珠结合的样品能够溶解于洗脱液中，以此纯化后的样品能够以液体形式与固态的磁珠分离，以此获得纯化后的样品。在本技术实施例中，洗脱液只要保证适于溶解样品即可，例如可以为市售的核酸溶解液等，本技术对洗脱液的种类和成分不作限制。
41.在本技术实施例中，该无乙醇洗脱的方法中不使用乙醇。可以理解的是，在本技术实施例提出的无乙醇洗脱方法中，无需使用乙醇对磁珠进行多次重复洗涤，即省略了乙醇洗涤这一传统步骤，并同样实现了稳定的洗脱和纯化效果。在一些实施例中，无乙醇洗脱的方法的具体操作流程可以为：(1)在需要进行洗脱的样品中加入磁珠结合液；(2)待样品和磁珠结合液进行充分接触以基于与磁珠的结合进行样品纯化(3-5分钟)；(3)将结合后的混合液置于磁力装置中，待固体的磁珠在磁力的作用下与液体分离后丢弃液体；(4)在磁珠中加入洗脱液；(5)待样品和洗脱液进行充分结合(3-5分钟)；(6)取出含纯化后样品的洗脱液。
42.与相关技术中的基于磁珠的洗脱方法相比，本技术实施例中的洗脱方法无需实时配置乙醇，也无需使用乙醇进行反复洗涤，由此大大简化了实验操作，节约了时间成本和人力成本。
43.在本技术实施例中提出的无乙醇洗脱方法的基础上，本技术实施例第二方面提出了一种无乙醇建库的方法，其中可以将本技术第一方面任一实施例中提出的无乙醇洗脱的方法应用至建库流程中的任一纯化步骤。在本技术实施例中，该无乙醇建库的方法可以包括：使用如本技术第一方面任一实施例中提出的无乙醇洗脱的方法进行以下中的至少一个：样品片段化产物纯化、接头连接产物纯化、pcr产物纯化和消化产物纯化。
44.图2为根据本技术实施例的无乙醇建库方法示意图。如图2所示，本技术实施例提出的无乙醇建库方法可以包括：样品片段化、末端修复、接头连接、环化和消化，其中在接头连接后、环化前，还可以对接头连接产物进行pcr扩增。相应地，可以在样品片段化、接头连接、pcr扩增和消化后，利用磁珠对这些步骤中的任一或全部的产物进行产物纯化，即本技术实施例中的无乙醇建库方法还可以包括：样品片段化产物纯化、接头连接产物纯化、pcr产物纯化和消化产物纯化中的任一或其任意组合。在本技术实施例中，样品片段化产物纯化、接头连接产物纯化、pcr产物纯化和消化产物纯化中均不使用乙醇。
45.在本技术实施例中，样品片段化产物纯化具体可以包括：将样品片段化，以获得样品片段化产物；将磁珠与样品片段化产物接触，以获得磁珠-样品片段化产物；和使用洗脱液将样品片段化产物洗脱，以获得纯化后的样品片段化产物，其中，所述洗脱中不使用乙醇。在本技术实施例中，无乙醇建库方法具体还可以包括：将所述样品片段化，以获得样品片段化产物；将磁珠与样品片段化产物接触，以筛选出具有期望片段长度的样品片段化产物，其中具有期望片段长度的样品片段化产物与磁珠特异性结合；和使用洗脱液将具有期望片段长度的样品片段化产物从磁珠上洗脱，以获得筛选后的样品片段化产物。在本技术实施例中，该样品片段化产物筛选涉及的洗脱中不使用乙醇。
46.可以理解的是，在本技术实施例中，样品片段化产物纯化可以利用磁珠，对打断后的样品进行纯化，其间不使用乙醇洗涤。进一步地，还可以利用磁珠对样品片段化产物进行片段筛选，并基于无醇洗脱的方法获得筛选后的样品片段化产物。由此，筛选后的样品片段化产物均有均一的期望片段长度，以此满足后续的上机测序要求；同时，该片段筛选步骤基于无乙醇洗脱方法，省略了多次乙醇洗涤过程，由此简化了实验操作，节约了时间成本和人力成本。
47.在本技术实施例中，可以使用酶切和/或超声进行样品的片段化。在本技术实施例中，期望片段长度可以根据后期测序仪要求确定。在一些实施例中，在使用二代测序仪时，期望片段长度可以为100-700bp，优选为250-375bp，更优选为300-350bp，最优选为350bp。
48.在本技术实施例中，还可以基于无醇洗脱的方法对接头连接产物进行纯化。在一些实施例中，在接头连接后、接头连接产物纯化前，该无乙醇建库的方法还包括：向接头连接产物中加入稀释液。可以理解的是，稀释液的加入能够稀释并缓冲接头连接产物中存在的大量聚乙二醇，使得连接反应液不再粘稠，以此在无乙醇洗涤的情况下，保证磁珠免于聚乙二醇的影响，能够正常与接头连接产物结合以进行接头连接产物的纯化。
49.在本技术实施例中，稀释液包括但不限于单蒸水、双蒸水、无核酶水、tris-hcl缓冲液、te缓冲液、ae缓冲液或其组合。
50.在本技术实施例中，接头连接产物纯化可以包括一次基于磁珠-接头连接产物结合物的洗脱。在本技术另一些实施例中，接头连接产物纯化可以包括两次或更多次的基于磁珠-接头连接产物结合物的洗脱。在本技术实施例中，“基于磁珠-接头连接产物结合物的洗脱”是指通过向待纯化的接头连接产物中加入磁珠，其中磁珠能够与连有接头的片段化样品特异性结合，以此形成磁珠-接头连接产物结合物；接着，利用无乙醇洗脱技术，对该磁珠-接头连接产物结合物进行洗脱，即得到溶有接头连接产物的洗脱液，以此筛选出连有接头的片段化产物，完成接头连接步骤产物的纯化。可以理解的是，通过一次或连续两次或更多次的基于磁珠-接头连接产物结合物的洗脱，能够使接头连接产物的纯化进行的更为彻底，使接头连接体系中使用的接头、酶等成分的残留量更低，从而有利于后续步骤的进行。
51.在本技术实施例中，还可以基于无醇洗脱的方法对消化产物进行纯化。类似地，该纯化过程基于磁珠与消化产物的结合物，并省略乙醇洗涤步骤得到纯化后的消化产物。在一些实施例中，在环化后、消化产物纯化前，该无乙醇建库的方法还包括：使用消化酶处理环化产物以获得所述消化产物。在一些实施例中，该消化酶可以为线性片段消化酶。可以理解的是，通过使用消化酶处理环化产物的反应体系，能够消解环化产物体系中残留的线性核酸片段，例如残留的接头序列、未环化的片段等，而仅保留体系中的环状片段，以使得后期省略乙醇洗涤的消化产物纯化步骤所得的杂质更少，有利于后期步骤的进行，例如dna纳米球(dna nano ball，dnb)的制备等。
52.在本技术实施例中，消化酶可以为核酸外切酶iii。
53.需要说明的是，本技术实施例中的其它纯化步骤可以根据磁珠使用说明进行，并且其间省略乙醇洗涤步骤。具体纯化过程在此不再赘述。
54.本技术实施例提出的无乙醇建库的方法，在各个基于磁珠进行的纯化步骤中省去了乙醇洗涤的步骤，有效减少了操作时间并简化了操作步骤，并且能够保证建库质量和后续测序的数据稳定性；同时通过适当引入线性片段消化酶和稀释液等处理，保证了即使在
无乙醇洗涤的情况下，各个基于磁珠的纯化步骤仍能对该步骤对应的产物具有优异的纯化效果，从而大大减少建成文库中的不期望的残留物含量。本技术实施例提出的无乙醇建库的方法省去了传统的人工操作的乙醇配置和乙醇洗涤步骤，使高通量流程化无人工操作的建库流程成为可能。
55.在本技术第二方面任一实施例提出的无乙醇建库的方法的基础上，本技术第三方面实施例提出了一种自动化无乙醇建库试剂盒。该自动化无乙醇建库试剂盒可以包括：建库试剂板；接头试剂板；和磁珠试剂板，其中，建库试剂板包含建库试剂，该建库试剂可以包含：样品片段化试剂、接头连接试剂和可选地pcr反应试剂、环化试剂和消化试剂；接头试剂板包含用于测序的接头；磁珠试剂板包含磁珠、洗脱液和可选地稀释液，并且其中磁珠试剂板中不包含乙醇。
56.可以理解的是，本技术实施例中的自动化无乙醇建库试剂盒以预制板的形式，将建库过程中所需的所有试剂进行了预先灌装；同时，基于本技术第二方面任一实施例提出的无乙醇建库的方法，建库流程免于需要手动操作的乙醇配置和洗涤步骤，由此通过结合自动化平台(例如华大智造mgi-sp-960或mgi-sp-100平台)，用户仅需在该自动化无乙醇建库试剂盒中加入样品，即可实现全自动化建库，而无需任何额外的手工操作，由此节约了用户自行准备各个反应体系的时间、并大大提高了建库通量。
57.图3为根据本技术实施例的自动化无乙醇建库试剂盒的展示图。如图3所示，该自动化无乙醇建库试剂盒中的建库试剂板包含样品片段化试剂、接头连接试剂和环化试剂。可以理解的是，建库试剂板中各步骤的建库试剂以及接头试剂板中的接头可以根据用户需要自行选择，只要能够实现相应的建库步骤即可，例如选择市售的各建库试剂和接头等，本技术对此不作限制。
58.如图3所示，磁珠试剂板中包含：纯化用磁珠，用于上述需要进行纯化的各个步骤；和两份洗脱试剂，该洗脱试剂不含乙醇，用于洗脱与磁珠结合的产物并使该产物溶于该试剂中，以获得纯化产物。可以理解的是，在本技术实施例中，洗脱试剂的量可以根据实际需要调整，即只要保证磁珠试剂板上包含足量的洗脱试剂以回溶产物即可，本技术对洗脱试剂的提供量不作限制。
59.本技术实施例提出的自动化无乙醇建库试剂盒的各试剂板中不含乙醇，并且也无需客户后期人工添加乙醇，由此基于该建库试剂盒能够实现全自动化无人工操作的全流程建库，即可以在加入样品后直接放置于自动化建库平台(例如华大智造公司的sp-960/sp-100自动化工作站)进行自动化建库，操作极度简便，且建库效果仍然能保持稳定。
60.此外，本技术实施例提出的自动化无乙醇建库试剂盒的各试剂板中保证了分装入的试剂的稳定性，确保了充足的预留量，并且能够防试剂挥发、防试剂污染，且能够进行长距离运输。
61.本技术实施例提供的无乙醇洗脱的方法及基于该方法提出的无乙醇建库的方法及自动化无乙醇建库试剂盒适用于各类型的文库构建，例如二代测序和三代测序中的文库构建，例如dna文库构建、rna文库构建、捕获文库构建等。
62.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
63.实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
64.实施例1
65.本实施例使用千人基因组标准品(购自coriell institute，货号：na12878)作为测试样本，并使用mgieasy fast pcr-free酶切文库制备试剂套装(mgi，cat#940-000026-00)进行二代测序中的文库构建。分别设置对照组和实验组，其中对照组严格根据该套装的产品说明书进行建库，包括使用乙醇对各个步骤的纯化产物进行洗涤；实验组同样基于该套装的产品说明书进行操作，但在各个步骤的产物纯化中省去了乙醇洗涤步骤。实验组的具体部分操作如下。
66.1.基因组片段化
67.1.1取测试样本dna于0.2ml pcr管中，体积应≤45μl，不足45μl部分用1x te buffer补足。将pcr管涡旋震荡3次，每次3s，离心后置于冰上备用。
68.1.2将mgi easy fast pcr-free酶切文库制备试剂套装中的fast fs buffer和fast fs enzyme在冰上配制酶切打断反应液(见表1)，混匀并瞬时离心后置于冰上待用。
69.表1酶切打断反应液
[0070][0071]
1.3将15μl配制好的酶切打断反应液加入1.1的测试样本dna中并混匀。
[0072]
1.4按照表2的反应条件设置pcr程序并运行，打断时间参考表8，待温度降至4℃后，将pcr管置于pcr仪上跳过第一步(4℃hold)开始反应。热盖温度保持70℃，以得到打断产物，即样品片段化产物。
[0073]
表2酶切打断反应条件
[0074][0075][0076]
2.样品片段化产物纯化
[0077]
2.1提前30min取出mgi easy fast pcr-free酶切文库制备试剂套装中的en-beads置于室温，使用前充分震荡混匀。
[0078]
2.2用移液器吸取48μl en-beads至步骤1.4的60μl打断产物中，充分混匀后室温孵育5min。
[0079]
2.3将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。
[0080]
2.4保持离心管置于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。
[0081]
2.5将离心管从磁力架上取下，加入45μl mgi easy fast pcr-free酶切文库制备试剂套装中的en-te。
[0082]
3.接头连接
[0083]
3.1提前取出mgi easy fast pcr-free酶切文库制备试剂套装中的udb adapters、fast ligation buffer溶解并涡旋混匀，ad ligase上下颠倒5-10次至充分混匀后，均瞬时离心后置于冰上备用。
[0084]
3.2在步骤2.5中所得产物的离心管中加入5μl udb adapter或稀释后的udb adapter，涡旋震荡并瞬时离心将反应液收集至管底。
[0085]
3.3在冰上配制接头连接反应液(见表3)，并用移液器缓慢吸取30μl配制好的接头连接反应液加入步骤3.2的pcr管中，涡旋震荡后瞬时离心将反应液收集至管底。
[0086]
表3接头连接反应液的配制
[0087][0088]
3.4将pcr管置于pcr仪上，按照表4中的条件进行反应，总反应体积80μl。
[0089]
表4接头连接反应条件
[0090][0091]
3.5反应结束后加入22μl en-te作为稀释液至pcr管中。
[0092]
4.连接产物纯化
[0093]
4.1提前30min取出en-beads置于室温，使用前充分震荡混匀。
[0094]
4.2用移液器吸取20μl en-beads至步骤3.5的接头连接产物中并混匀。
[0095]
4.3室温孵育5min。
[0096]
4.4瞬时离心，将pcr管置于磁力架，静置2～5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。
[0097]
4.5将pcr管从磁力架上取下，加入40μl en-te进行dna洗脱，并混匀。
[0098]
4.6室温下孵育5min。
[0099]
4.7瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，静置2～5min至液体澄清，将38μl上清液转移到新的0.2ml pcr管中。
[0100]
4.8用移液器吸取38μl en-beads至步骤4.7的产物中，并混匀。
[0101]
4.9室温孵育5min。
[0102]
4.10瞬时离心，将pcr管置于磁力架，静置2～5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。
[0103]
4.11将pcr管从磁力架上取下，加入40μl en-te进行dna洗脱，并混匀。
[0104]
4.12室温下孵育5min。
[0105]
4.13瞬时离心，将pcr管置于磁力架上，静置2～5min至液体澄清，将38μl上清液转移到新的0.2ml pcr管中。
[0106]
后续步骤参考相关环化试剂盒(mgieasy双barcode环化试剂盒，cat#1000020570)和测序试剂盒(mgiseq-2000rs高通量测序试剂套装(fcl pe150)，cat#1000012555)说明书。
[0107]
5.效果对比
[0108]
基于dnbseq平台，对本实施例中的对照组(使用乙醇洗涤)和实验组(省略乙醇洗涤步骤)所建文库进行全基因组测序，技术比对和所得数据的数据表现如下表表5所示。
[0109]
表5
[0110] 实验组对照组自动化可行性无需手工配制试剂需要手工配制试剂建库时长约120分钟约135分钟测序数据质量指标q3091.94591.655基因组比对指标20
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覆盖度94.5393.19单核苷酸突变检测灵敏度0.99510.9953单核苷酸突变检测精确度0.99940.9993
[0111]
如表5所示，与使用了常规含乙醇建库技术的对照组相比，本实施例中实验组使用的无乙醇建库技术能够实现全流程的自动化，而无需进行乙醇溶液的手工配制和添加；同时，在免于乙醇洗涤的情况下，实验组的建库时长有效缩短了15min(120vs 135)，由此在进行大规模高通量建库的情况下，能够大大简化操作流程、节约建库时间。在数据表现上，实验组的测序数据质量指标q30以及基因组比对指标20
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覆盖度均高于对照组，并且在单核苷酸突变检测的灵敏度和精确度上略高于对照组或与对照组相当，说明本技术实施例提出的无乙醇建库方法在省略实验步骤缩短了建库时长的情况下，保持了数据质量，实现了稳定的建库和测序。
[0112]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结
合和组合。
[0113]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。