用于清除物表核酸污染的水溶液及其湿巾的制作方法

1.本发明涉及核酸检测领域，特别涉及用于清除物表核酸污染的水溶液及其湿巾。


背景技术：

2.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)自问世以来发展迅速，在各个领域都有重要应用。pcr通过变性、退火、延伸这三个阶段温度的循环，能将极少量的dna模板扩增数百万倍，具有极高的检测敏感性。正是由于pcr高敏感性的特点，实验过程中的任何一个环节发生的极其微量的dna污染，也足以导致假阳性结果的产生，因而在pcr实验中,控制实验室核酸污染是保证实验结果准确的重要一环。核酸污染一般发生在样本处理环节抽提核酸和检测环节扩增产物泄露，其中最令人头疼的是pcr扩增产物污染，即pcr气溶胶污染。气溶胶为悬浮于气体介质中粒径一般为0.001μm～1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。虽然目前大多pcr反应是闭管的荧光定量pcr，但pcr产物拷贝数多，一般为10
13
拷贝/ml，在不断热循环的条件下，任何一点纰漏都容易形成pcr气溶胶。形成的气溶胶飘浮在空气中，黏附到物体表面及检测人员身体上，随着人员及物料流动而污染整个实验室。据测算，一个气溶胶颗粒可能含有48000个拷贝的pcr产物，已远远高于pcr的检测灵敏度，造成假阳性的结果。
3.目前通过严格分区物理隔绝的方法防止核酸污染，但核酸检测步骤较多，灵敏度极高，且多个环节样本直接暴露于空气中，核酸污染依然无法彻底避免。尤其物表核酸污染，不像空气中气溶胶污染，可以通过通风、负压来清除，它需要有效的核酸清除方法。
4.目前实验室常用的物表核酸清除方法有物理、化学方法和酶法。物理方法中使用较多的是紫外线清除，比如紫外线照射12～18小时，对空气中大于500bp的核酸污染有一定清除效果，但紫外线的清除作用距离在80cm～100cm之间，且对200bp以下的短片段核酸不敏感，所以对污染有小于200bp的pcr产物的物表，清除效果并不理想。在核酸污染化学清除方法中，主要使用一些具有强氧化性的化合物，包括过氧化氢或过氧乙酸、一些含氯化合物等。比较常见的是含氯84消毒液，虽对物表核酸清除有一定效果，但这种含氯消毒剂的稳定性差，有效期短，对金属物表有一定腐蚀作用。而其他常规消毒剂如酒精，其实是核酸提取试剂中的一个组分，对核酸没有任何降解作用。酶法清除其实是通过核酸酶快速与单链、双链、线性、环状等各种形式的dna或rna进行反应，将其降解为3至5个碱基长度的5'-单磷酸寡核苷酸。但这种核酸酶作用没有选择性，还会残留在各种物表，形成次生污染，降解后续样本中的核酸模板，尤其是一些弱阳性的标本，导致出现假阴性结果，所以不适合用来清除物表的核酸污染。
5.cn20211042978.3和cn202210026958.2公开了一种清除pcr气溶胶污染的喷剂，主要含有过氧化物、表面活性剂等，尝试通过过氧化物的氧化特性，特异性的氧化dna核酸分子，达到清除核酸污染的目的。但过氧化物是强氧化剂，不够稳定，很短的时间内就降解成水和氧而失去活性，且对人体有害，实验室大多用于消毒，对核酸的降解作用较弱，一般需用高浓度的过氧化物才能达到一定的核酸降解作用，所以实际使用效果有限。
cn201911003447.3和cn202111352515.4公布的核酸去除剂，它含有过氧化氢，次氯酸钠，酸性物质等，两者的ph均为酸性。一般ph值为3.5～4.5时过氧化氢的稳定性较好，但次氯酸钠只有在碱性环境中才能稳定，在酸性环境中极易降解失效。因此这些清除剂作用物表的核酸清除，处理效果均不佳，寻找一种使用方便、安全、有效、稳定、经济的物表核酸污染清除方法是核酸检测实验室的当务之急。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提一种用于清除物表核酸污染的水溶液，所述溶液包括有效氯含量质量百分比浓度为0.1％-0.5％的次氯酸盐，所述溶液的ph为10-12。
7.在一种实施方式中，所述溶液包括有效氯含量质量百分比浓度为0.1％-0.5％的次氯酸钠，所述溶液中还包括碳酸氢钠和氢氧化钠。
8.在一种实施方式中，所述溶液包括有效氯含量质量百分比浓度为质量百分比浓度为0.25-0.5％次氯酸钠、质量百分比浓度为0.25％氢氧化钠和质量百分比浓度为0.25％碳酸氢钠。
9.在一种实施方式中，所述溶液中还包括两种稳定剂硅酸钠和edta。
10.在一种实施方式中，所述溶液还包括质量百分比浓度为1％的硅酸钠和0.01％的edta。
11.在一种实施方式中，所述溶液还包括十二烷基二苯醚二磺酸钠。
12.在一种实施方式中，所述溶液包括有效氯含量质量百分比浓度为0.5％次氯酸钠、质量百分比浓度为0.25％氢氧化钠、质量百分比浓度为0.25％碳酸氢钠、质量百分比浓度为1％硅酸钠、质量百分比浓度为0.01％edta和质量百分比浓度为1％十二烷基二苯醚二磺酸钠。
13.在一种实施方式中，本发明提供一种核酸清除湿巾，所述核酸清除湿巾用上述的水溶液浸泡水刺无纺布制成。
14.本发明用于清除物表核酸污染的水溶液包括含次氯酸盐、碱性物质、稳定剂、表面活性剂和水，其中所述含次氯酸盐通过氧化作用破会dna的一级及二级结构，次氯酸盐包括但不限于次氯酸钠、次氯酸以及含有次氯酸根的化合物；所述碱性物质能破坏dna的磷酸二酯键和氢键，碱性物质包括但不限于naoh、nahco3、na2co3等强碱或碱性的盐溶液；所述稳定剂能够保持含氯化合物的稳定性，稳定剂包括但不限于na2sio3，edta或碳酸盐；所述表面活性剂通过疏水力非离子表面活性剂与dna的氢键发生作用降解dna，且能够增强其他组分溶解度，表面活性剂不限于十二烷基二苯醚二磺酸钠(cr-mads)、脂肪醇聚乙烯醚硫酸钠等阴离子表面活性剂。
15.核酸污染清除方法，尤其是物表核酸污染清除方法，大多使用商品化的清除剂配合喷壶，喷洒物表，再用无纺布擦拭，所使用的清除剂主要组分多为用于消毒的过氧化物，而实验室自配试剂，是将用于消毒的84消毒液稀释后擦拭物表，存在操作不便，喷洒不均匀，同时普通84消毒液对核酸清除效率不高，稳定性不好。针对上述问题，本发明提供一种核酸污染清除湿巾，其中湿巾液为核酸清除剂，操作方便、活性高，稳定性好，用于快速清除pcr实验室物表的核酸污染。湿巾液以对核酸降解有一定效果的次氯酸钠为主要原料，从提高次氯酸钠活性和稳定性入手，探索能直接用于核酸污染清除的专用清除剂。次氯酸钠溶
液的活性和稳定性易受光照、浓度、温度、金属阳离子杂质、ph值等因素影响。在诸多因素中，最重要的是溶液的ph值。正常情况下，碱性环境有利于次氯酸根溶液的储存和使用，但过大的ph值又能抑制氢离子对次氯酸根溶液的分解，从而降低其降解核酸的速度；其次是次氯酸钠的浓度，其浓度越高，虽有效氯含量越多，但稳定性越低；同时次氯酸钠溶液中含有的金属离子杂质也会影响其活性和稳定性。本发明通过探索不同的碱性条件及次氯酸钠的浓度，同时通过添加稳定剂，降低次氯酸钠溶液中的金属离子杂质，来提高次氯酸钠对核酸降解的活性和稳定性。
具体实施方式
16.为了使本领域技术人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本技术保护的范围。以下实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
17.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂，均为市售产品。
18.实施例1：模拟物表pcr扩增产物污染
19.为验证本发明核酸清除湿巾的清除性能，以实验台面为例模拟物表的pcr扩增产物污染。具体实施方法：合成检测猫肺炎支原体的引物和探针，用阳性对照品作为扩增模板，通过pcr扩增，反应液作为污染用的pcr产物。荧光定量pcr仪为上海宏石slan 96s荧光定量pcr仪，引物和探针见表1，按表2的体积配制反应体系，按表3的扩增程序进行扩增。
20.表1用于猫肺炎支原体检测的引物和探针
21.名称序列正向引物5
’‑
gcttacagctattagttcact-3’反向引物5
’‑
tgttgtcacagttaagaggaac-3’探针5
’‑
rox-acttgcgatgcagattggagtgctgag-bhq2-3’22.表2猫肺炎支原体扩增体系
[0023][0024]
表3猫肺炎支原体扩增程序设置
[0025][0026]
将扩增好的核酸产物取20μl加入50ml去离子水中，放入喷壶中，均匀喷洒于实验台面的多个20cm
×
20cm区域，其中一个可作为阳性对照，标记好喷洒区域界限，关闭门窗，静置1小时，直至其充分自然晾干，作为核酸污染区域备用。
[0027]
实施例2：不同含氯化合物湿巾的物表核酸污染清除效果
[0028]
本实施例中选择含氯化合物中能够分解产生很强氧化性的羟基自由基能力的次氯酸和次氯酸钠，通过氧化性直接破坏核酸的一级和二级结构，用作湿巾液中核酸污染清除的主要原料。含氯化合物的浓度一般以有效氯含量来计算，用mg/l或％(g/100ml)浓度表示。两种含氯化合物的测试浓度按各自推荐浓度稀释成梯度。次氯酸的有效氯含量为100-120mg/l，换算成百分比为0.01％-0.012％(g/100ml)，分别用纯水稀释成0.01％、0.005％、0.0025％三个浓度梯度的样品，用作次氯酸湿巾液；次氯酸钠溶液的有效氯含量为6％(g/100ml)，分别用水稀成0.25％、0.1％、0.05％三个浓度梯度的样品，用作次氯酸钠湿巾液。取规格一样的水刺无纺布，湿巾液的使用量是无纺布质量的3.5倍，将无纺布浸泡润湿12小时，制备成湿巾。按实施例1中的方法模拟6块20cm
×
20cm的pcr产物污染实验台面。污染清除之前每个污染区域取样作为清除前对照，采用物表擦拭法取样，即5cm
×
5cm标准涂擦法，用浸有纯净水的棉拭子按照标准横竖往返均匀涂擦5次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子放入无菌的1ml无菌水中浸泡30min后弃棉拭子，对棉拭子浸泡液进行核酸检测。清除前对照样本取完后，用配制好的含不同浓度次氯酸和次氯酸钠的湿巾，分别擦拭实施方案1中所述的6块污染的实验台面，擦拭方法为从上到下，从左到右，单向均匀擦拭，每次更换新湿巾，重复上述擦拭操作2次，湿巾擦拭后，停留10分钟，喷洒75％的酒精，用灭菌无纺布擦拭。清除后的物表核酸样本取样同清除前的对照样本。pcr检测方法同实施例1中模拟污染的pcr扩增，每个区域清除前和清除的样本分别取样检测3次。核酸污染清除效果评估：统计每个区域清除前和清除后的3个样本的ct值，计算均值，计算δct＝清除后样本扩增ct值-清除前样本扩增ct值，δct愈大，表明清除效果愈明显，试验区无ct时，表明污染完全清除，清除效率最高。不同浓度次氯酸的清除效果见表4，不同浓度次氯酸钠的清除效果见表5。
[0029]
表4不同浓度次氯酸对核酸污染的清除效果
[0030][0031]
表5不同浓度次氯酸钠对核酸污染的清除效果
[0032][0033]
对比表4、表5中的结果，可以可见，次氯酸与次氯酸钠作为湿巾液的主要原料，0.01％有效氯含氯的次氯酸和0.25％有效氯含量的次氯酸钠的δct值分别为10.8和10.7，相差0.1，非常接近。表明两种含氯化合物对物表模拟的核酸污染清除效果相近，但鉴于次氯酸在清除效果最好的浓度时，次氯酸的浓度较高，已经和次氯酸原液很接近，而次氯酸钠的效果最显著的浓度是通过近20-30倍稀释而来，考虑到次氯酸的使用浓度太高，故选择次氯酸钠作为湿巾液的氧化性组分。
[0034]
实施例3：不同碱性条件下湿巾配方的物表核酸污染清除效果
[0035]
结合实施例2中的结果，0.25％有效氯含量的次氯酸钠溶液有显著的核酸污染清除效果。影响次氯酸钠活性的一个重要因素是ph值。一般情况下，碱性环境有利于次氯酸钠溶液的储存和使用。而过大的ph值又能抑制氢离子对次氯酸根溶液的分解，从而降低其对核酸的降解作用。本实施例通过在湿巾液中添加不同的碱性物质：naoh、nahco3或na2co3，调节湿巾液的ph值，筛选合适的湿巾液的碱性条件。按表6的方案进行湿巾液的配制，其中次氯酸钠的浓度按照有效氯含量来配制，而碱性物质按照质量百分比来配制，余量为超纯水。模拟7块pcr产物污染的物表方法同实施例1，制备湿巾的流程、清除前后样本的取样及检测方法同实施例2。检测结果见表7。
[0036]
表6不同碱性条件湿巾液配制方案
[0037]
方案组分ph值方案10.25％次氯酸钠9.0方案20.25％次氯酸钠+0.5％氢氧化钠13方案30.25％次氯酸钠+0.5％碳酸氢钠310方案40.25％次氯酸钠+0.5％碳酸钠11方案50.25％次氯酸钠+0.5％氢氧化钠+0.5％碳酸氢钠12方案60.25％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠12方案70.25％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠+0.25％碳酸钠11
[0038]
表7不同碱性条件下湿巾配方的物表核酸污染清除效果
[0039][0040]
从表7可以看出，相比单独次氯酸钠溶液方案1，方案2-4分别加入0.5％的氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸氢钠，δct值均有所提高，显示均有助于次氯酸钠对核酸的降解作用。这是因为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸氢钠可以增加溶液的ph值，增加次氯酸钠溶液稳定性和活性。相比方案5中在加入0.5％的氢氧化钠，方案6中加入0.25％的氢氧化钠和碳酸氢钠，对其核酸降解活性反而升高，表明0.5％的naoh可能由于ph的升高，可能影响核酸降解活性，而方案7中，添加0.25％的碳酸钠相比方案6，核酸降解效果变化不明显，从经济性考虑选择方案6的0.25％次氯酸钠、0.25％氢氧化钠、0.25％碳酸氢钠作为湿巾液的配方，ph值为12。
[0041]
实施例4：不同浓度次氯酸钠湿巾的物表核酸污染清除效果
[0042]
从实施例3的结果可以看出ph值为12的0.25％次氯酸钠、0.25％氢氧化钠、0.25％碳酸氢钠作为湿巾液配方，对核酸污染清除效果较好。本实施例在不改变碱性条件的情况下，进一步摸索对核酸污染清除效果更为明显的次氯酸钠浓度。按表8的方案8-12进行湿巾液的配制，其中次氯酸钠的浓度按照有效氯含量来配制，而碱性物质按照质量百分比来配制，余量为超纯水。模拟5块pcr产物污染的物表方法同实施例1，制备湿巾的流程、清除前后样本的取样及检测方法同实施例2。检测结果见表9。
[0043]
表8不同浓度次氯酸钠湿巾液配方
[0044]
方案组分方案80.1％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠方案90.25％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠方案100.5％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠方案110.75％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠方案121％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠
[0045]
表9含不同浓度次氯酸钠清除剂的湿巾对物表核酸污染的清除结果
[0046][0047]
从表9的结果来看，随着次氯酸钠有效氯含量从0.1％提高到0.5％，δct值依次从12.8上升到13.3，说明随着浓度升高，清除效率在提高，但到了0.5％以后，方案11和12中的次氯酸钠浓度后，δct值相差变小，提高次氯酸钠浓度对核酸降解能力有一定降低。由于次氯酸钠的稳定性和它的浓度相关，碱性条件下，浓度越低，其稳定性越好，在确保清除效率的情况下，选择方案10的0.5％次氯酸钠、0.25％氢氧化钠、0.25％碳酸氢钠作为湿巾液配方。
[0048]
实施例5：稳定剂组分对物表核酸污染清除效果的影响
[0049]
本发明的湿巾液主要成分为次氯酸钠，而次氯酸钠溶液的稳定性易受光照、浓度、温度、金属阳离子杂质、ph值等影响。实施例3、4通过摸索次氯酸钠溶液的碱性环境和次氯酸钠浓度提高次氯酸钠的活性和稳定性。本实施例通过在次氯酸钠溶液中添加稳定剂来改善储存条件和去除金属离子杂质，从而达到增加湿巾液的稳定性目的，同时通过增加阴离子表面活性剂增加次氯酸钠溶液活性和增加其它组分的溶解性。次氯酸钠常见的稳定剂有硅酸钠，通过添加金属离子螯合剂edta降低溶液中的金属阳离子杂质，而表面活性剂选择阴离子表面活性剂十二烷基二苯醚二磺酸钠(cr-mads)。按照表10方案11-15稳定剂的配方制备湿巾液，模拟5块pcr产物污染的物表方法同实施例1，制备湿巾的流程、清除前后样本
的取样及检测方法同实施例2。检测结果见表11。
[0050]
表10稳定剂组分湿巾液配方
[0051]
方案组分方案130.5％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠+1％硅酸钠方案140.5％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠+0.01％edta方案150.5％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠+1％硅酸钠+0.01％edta方案160.5％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠+0.5％硅酸钠+0.005％edta方案170.5％次氯酸钠+0.25％氢氧化钠+0.25％碳酸氢钠+1％硅酸钠+0.01％edta+1％cr-mads
[0052]
表11稳定剂组分对物表核酸污染清除效果的影响
[0053][0054][0055]
从表11可见，方案13、14中分别加入1％的硅酸钠和0.01％的edta和同时加入两种稳定剂的方案15相比，同时加入两种物质的清除效率δct值从12.1上升到12.6，略微升高，而添加0.5％的硅酸钠和0.005％的edta的稳定剂对次氯酸钠溶液清除核酸活性的影响要小，说明方案15中加入1％的硅酸钠和0.01％的edta的稳定剂对次氯酸钠溶液后，具有协同促进作用。在方案15的基础上，进一步添加1％的阴离子表面活性剂十二烷基二苯醚二磺酸钠(cr-mads)，从清除效率的δct值来看，δct值达到13.5，比方案15有显著提高，说明表面活性剂十二烷基二苯醚二磺酸钠(cr-mads)同样能够促进次氯酸钠溶液对核酸污染的清除效果。鉴于上述结果，选择本发明湿巾液的配方为方案17：0.5％次氯酸钠、0.25％氢氧化钠、0.25％碳酸氢钠、1％硅酸钠、0.01％edta和1％十二烷基二苯醚二磺酸钠。
[0056]
实施例6：本发明湿巾在储存期内物表核酸污染清除效果的验证
[0057]
实施例5验证了添加了稳定剂和表面活性剂的次氯酸钠溶液对核酸污染的清除效果，本实施例进一步验证添加又稳定剂的湿巾液的稳定性。按照方案13、方案14、方案15、方案16和方案17的配方制备湿巾液，按照实施例2将湿巾液制备成湿巾，将湿巾密封后储存在避光、阴凉的地方，分别在湿巾后6月分别取出若干，每次模拟1块pcr产物污染的物表，方法
同实施例1，清除前后样本的取样及检测方法同实施例2。检测结果见表12。
[0058]
表12本发明湿巾在6个月后对物表核酸污染清除效果
[0059][0060]
从表12结果可以看出，湿巾制备后6月和对照相比，核酸扩增的结果δct值均在11.6-13.2，从实验结果可以看出，与实验方案13-16相比，本发明的方案17能够保持含氯化合物等易降解物质的稳定性，可以使清除剂在室温下保存至少半年，其对核酸污染降解作用没有发生明显改变。
[0061]
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
[0062]
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。