一种nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法
技术领域
1.本发明涉及细胞培养领域，特别是涉及一种nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法。
背景技术：
2.自然杀伤细胞（natural killer cell，nk）是机体重要的免疫细胞，主要分布在外周血中。nk细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。
3.nk细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增nk细胞，但上述方法扩增的nk细胞与临床需求仍存在一定的差距。如何提供一种可扩增出大量且高活性的nk细胞的培养基，是nk细胞体外扩增领域亟待解决的问题之一。在中国专利申请cn113897334a公开了pd-1阻断剂增强nk细胞杀伤力的用途。nk细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，nk细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放perforin、granzymeb到达靶细胞，perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导granzymeb进入靶细胞，granzymeb进入靶细胞后引发靶细胞的dna断裂使靶细胞凋亡。cd107a也是nk细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。
4.此外，在本技术的在先申请cn114606187a中，也公开了一种nk细胞培养基，其特征在于，所述培养基含有：10-20%fbs、50μg/ml 青霉素-链霉素溶液的1640培养基；10-200 mg/ml人血浆转铁蛋白；100um 1,3-二咖啡酰奎宁酸；1000 iu/ml 人重组il-2；10-200 iu/ml 人重组il-15；10-200 iu/ml 人重组il-18；10-200 iu/ml 人重组il-21。通过在培养基中加入1,3-二咖啡酰奎宁酸，能够显著增强nk细胞对k562的杀伤活性,并且该促进作用随着效靶比的增高而增强。
5.然而，在申请人的后续研究中发现，仅通过加入1,3-二咖啡酰奎宁酸，对于增强nk细胞对肿瘤细胞的杀伤活性的增长有限，为了解决该技术问题，申请人进行了进一步的研究并得以完成本发明。
技术实现要素：
6.本发明主要解决的技术问题是提供一种nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法，可扩增出活性高、杀伤性更强的nk细胞。
7.为解决上述技术问题，本发明的第一个方面，提供一种nk细胞培养基，所述培养基含有：10-20%fbs、40-60μg/ml 青霉素-链霉素溶液的1640培养基；10-200 mg/ml人血浆转铁蛋白；40-90μm 1,3-二咖啡酰奎宁酸；20-70μm 乙酰谷酰胺；
500-1500 iu/ml 人重组il-2；10-200 iu/ml 人重组il-15；10-200 iu/ml 人重组il-1810-200 iu/ml 人重组il-21。
8.在一种优选的实施方式中，所述培养基中1,3-二咖啡酰奎宁酸的量为50-80μm；优选为50-60μm。
9.在一种优选的实施方式中，所述培养基中乙酰谷酰胺的量为30-70μm；优选为30-40μm。
10.本发明的第二个方面，提供一种体外扩增nk细胞的方法，所述方法包括：将nk细胞悬于上述nk细胞培养基中，并将悬有nk细胞的培养基转移至细胞培养瓶中，并将细胞培养瓶置于培养箱中培养。
11.在一种实施方式中，在将nk细胞转移至细胞培养瓶时，将细胞密度调整为1-5
×
105个/ml。
12.在一种实施方式中，所述培养箱参数为湿度饱和、5%co2、37℃。本发明相对于现有技术获得了如下显著的进步：本发明首次公开了以特定的比例加入1,3-二咖啡酰奎宁酸和乙酰谷酰胺的组合刺激条件下，能够显著增强nk细胞的perforin、granzyme b、cd107a的表达水平，能够显著增强nk细胞对k562的杀伤活性。
具体实施方式
13.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
14.实施例1 ：nk细胞培养基的制备和体外扩增方法nk细胞培养基配制组分如下：含有 10%fbs、50μg/ml 青霉素-链霉素溶液的 1640 培养基；20mg/ml人血浆转铁蛋白；50μm 1,3-二咖啡酰奎宁酸；30μm 乙酰谷酰胺；1000 iu/ml 人重组il-2；50 iu/ml 人重组il-15；50 iu/ml 人重组il-21。
15.将上述培养基中100um 1,3-二咖啡酰奎宁酸组分去除，作为对照组。
16.体外扩增nk细胞的方法可按照如下方法进行：1. 人外周血单个核细胞 (pb
‑ꢀ
mc)的分离:静脉血肝素抗凝, hank' s液等体积稀释, 用 fi
‑ꢀ
coll进行密度梯度离心, 获取 pbmc, 充分洗涤后调整pbmc密度为 2
ꢀ×
10
9 /l:采用免疫磁珠法纯化nk细胞, 按试剂盒说明书操作 (流式检测表明, nk细胞的纯度 》95%)。
17.2. 将制备的nk细胞株悬于上述nk细胞培养基及对照组nk细胞培养基中，调整nk细胞的密度为1-5
×
105个/ml，转移到t75细胞培养瓶中培养，培养条件为湿度饱和、5%co2、
37℃的培养箱。
18.3. 收集继续培养48h的nk细胞，pbs洗涤并重悬调整细胞密度为1
×
106个/ml，接种于流式管中，每管0.1ml，用pe标记的穿孔素(perforin)、pe标记的颗粒酶b(granzyme b)、apc标记的cd107a孵育进行流式细胞术检测，检测结果如表1所示。
19.实施例2：与实施例1相同，其区别在于乙酰谷酰胺的量为50μm。
20.实施例3：与实施例1相同，其区别在于1,3-二咖啡酰奎宁酸的量为80μm。
21.比较例1：与实施例1相同，其区别在于不加入乙酰谷酰胺，1,3-二咖啡酰奎宁酸的量为100μm。
22.比较例2：与实施例1相同，其区别在于不加入1,3-二咖啡酰奎宁酸，乙酰谷酰胺的量为80μm。
23.表1：perforin、granzyme b、cd107a表达水平
24.上述实验结果表明，以特定的比例加入1,3-二咖啡酰奎宁酸和乙酰谷酰胺的组合刺激条件下，能够显著增强nk细胞的perforin、granzyme b、cd107a的表达水平。
25.实施例4：nk细胞对k562细胞的杀伤实验将上述细胞增殖能力实验中培养第15天的nk细胞作为效应细胞，以k562细胞为靶细胞。首先配制效应细胞溶液：取实施例1-3和比较例1-2培养至15天的nk细胞，用含2％fbs的rpmi 1640培养基洗2次，用含2％fbs的rpmi 1640培养基配成1
×
106/ml细胞悬液。靶细胞k562细胞用2％fbs的rpmi 1640培养基洗一次，用含2％fbs的rpmi 1640培养基配成1
×
105/ml细胞悬液。按效靶比10:1接种到96孔板内，同时设置效应细胞孔和靶细胞孔，按每种培养基3个复孔，37度5％co2培养24小时。用mtt法测吸光度值，即，每孔加入二甲基亚砜 150μl, 轻轻振荡, 用酶标仪测量 a490值，计算杀瘤率，结果如表2所示。其中：杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔。
26.表2：杀瘤率实验结果
27.实验结果显示，以特定的比例加入1,3-二咖啡酰奎宁酸和乙酰谷酰胺的组合刺激条件下，能够显著增强nk细胞对k562的杀伤活性。
28.综上所述，利用本发明的nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法，可扩增出活性高、杀伤性更强的nk细胞。
29.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。