1.本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种通过二次环化固相合成普卡那肽的方法。
背景技术：
2.普卡那肽(plecanatide)是一种由16个氨基酸组成的口服多肽，同时也是一种鸟苷酸环化酶-c激动剂，在临床上可刺激肠道分泌肠液和加速排便。目前与普卡那肽合成有关的专利及文献在构建肽序上分别有固相法、固液结合法；在形成两个二硫键的方法有一步成环法和分步成环法。其中，一步成环法虽然工艺简单，但是选择性差，杂质多，不环保，质量差；分步成环法优化了成环的选择性，但是步骤繁琐，影响了整体收率。
技术实现要素：
3.为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种通过二次环化固相合成普卡那肽的方法。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种通过二次环化固相合成普卡那肽的方法，包括如下步骤：
6.(1)在活化剂系统的存在下，将树脂固相载体与fmoc-leu-oh偶联，得fmoc-leu-树脂；
7.(2)通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽序依次偶联具有n端fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联的氨基酸顺序为：fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh；
8.(3)脱除cys(acm)的acm保护基，同时进行第一次环化反应，得一环肽树脂；
9.(4)脱除cys(mob)上的mob保护基，同时进行第二次环化反应，得二环肽树脂；
10.(5)脱fmoc保护基，裂解，纯化，冻干后得到普卡那肽。
11.优选的，步骤(1)中所述活化剂系统由diea和dmap组成，所述diea和dmap的体积比为1～3:1。
12.优选的，步骤(1)中所述活化剂系统、树脂固相载体、fmoc-leu-oh的用量比为5～8ml:20～25g:15～20g。
13.优选的，步骤(1)中所述树脂固相载体包括am树脂固相载体或2-ctc树脂固相载体。
14.优选的，步骤(2)中所述的固相合成方法具体为：
15.(2.1)采用去保护液脱除fmoc-leu-树脂上的fmoc保护基，得到h-leu-树脂；
16.(2.2)在偶联剂系统的存在下，h-leu-树脂和fmoc保护且侧链保护的半胱氨酸偶联得到fmoc-cys(acm)-leu-树脂；
17.(2.3)重复步骤(2.1)、(2.2)，按照普卡那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联。
18.优选的，步骤(2.1)中所述去保护液由哌啶、dbu和dmf组成，所述哌啶、dbu和dmf的体积比为1～3:1～3:95～100。
19.优选的，步骤(2.2)中所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂包括bop/hobt/nmm、dic/hobt/diea、dic/hoat/diea、hbtu/hobt/diea、hctu/nmm、hatu/diea、tatu/hoat/diea、dic/hobt/dmap中的一种或几种，所述反应溶剂包括dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或几种。
20.优选的，步骤(3)中所述第一次环化反应的条件为：由碘和过氧化叔丁醇按照2～4g:70～75ml的用量比混合作为反应试剂，20～30℃下反应1～1.5h。
21.优选的，步骤(4)中所述第二次环化反应的条件为：由20～30vt％的双氧水作为反应试剂，20～30℃下反应0.8～1.2h。
22.优选的，步骤(5)中所述脱fmoc保护基采用的试剂为去保护液，所述去保护液由哌啶、dbu和dmf组成，所述哌啶、dbu和dmf的体积比为1～3:1～3:95～100；所述裂解采用裂解液进行，所述裂解液由tfa、edt、h2o、tis按照90～95:1～3:1～3:1～3的体积比组成；所述纯化为采用高效液相色谱法进行纯化。
23.本发明中的缩写字母含义：
24.fmoc：芴甲氧羰基
25.acm：乙酰胺甲基
26.mob：对甲氧基苄基
27.dbu：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯
28.dmf：n，n
′‑
二甲基甲酰胺
29.bop：苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐
30.hobt：1-羟基苯骈三唑
31.nmm：n-甲基吗啡啉
32.dic：n，n
′‑
二异丙基碳化二亚胺
33.diea：n，n
′‑
二异丙基乙胺
34.hoat：1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
35.hbtu：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯
36.hctu：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
37.hatu：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯
38.tatu：o-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲四氟硼酸盐
39.dmap：4-二甲氨基吡啶
40.dcm：二氯甲烷
41.nmp：n-甲基吡咯烷酮
42.dmso：二甲基亚砜
43.tfa：三氟醋酸
44.edt：乙二硫醇
45.tis：三异丙基硅烷
46.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
47.本发明采用固相合成法可定向形成二硫键，具有效率高、副产物少、产品纯化难度低、产品收率高、纯度高的优点，适合普卡那肽的工业化规模生产制备。
具体实施方式
48.本发明提供了一种通过二次环化固相合成普卡那肽的方法，包括如下步骤：
49.(1)在活化剂系统的存在下，将树脂固相载体与fmoc-leu-oh偶联，得fmoc-leu-树脂；
50.(2)通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽序依次偶联具有n端fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联的氨基酸顺序为：fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh；
51.(3)脱除cys(acm)的acm保护基，同时进行第一次环化反应，得一环肽树脂；
52.(4)脱除cys(mob)上的mob保护基，同时进行第二次环化反应，得二环肽树脂；
53.(5)脱fmoc保护基，裂解，纯化，冻干后得到普卡那肽。
54.在本发明中，步骤(1)中所述活化剂系统优选由diea和dmap组成，所述diea和dmap的体积比优选为1～3:1，进一步优选为2:1。
55.在本发明中，步骤(1)中所述活化剂系统、树脂固相载体、fmoc-leu-oh的用量比优选为5～8ml:20～25g:15～20g，进一步优选为7ml:23g:18g。
56.在本发明中，步骤(1)中所述树脂固相载体优选包括am树脂固相载体或2-ctc树脂固相载体，进一步优选为am树脂固相载体。
57.在本发明中，步骤(2)中所述的固相合成方法具体为：
58.(2.1)采用去保护液脱除fmoc-leu-树脂上的fmoc保护基，得到h-leu-树脂；
59.(2.2)在偶联剂系统的存在下，h-leu-树脂和fmoc保护且侧链保护的半胱氨酸偶联得到fmoc-cys(acm)-leu-树脂；
60.(2.3)重复步骤(2.1)、(2.2)，按照普卡那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联。
61.在本发明中，步骤(2.1)中所述去保护液由哌啶、dbu和dmf组成，所述哌啶、dbu和dmf的体积比优选为1～3:1～3:95～100，进一步优选为2:2:97。
62.在本发明中，步骤(2.2)中所述偶联剂系统优选包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂优选包括bop/hobt/nmm、dic/hobt/diea、dic/hoat/diea、hbtu/hobt/diea、hctu/nmm、hatu/diea、tatu/hoat/diea、dic/hobt/dmap中的一种或几种，进一步优选为bop/hobt/nmm，所述bop/hobt/nmm中bop、hobt和nmm的体积比优选为1～2:3～5:2～4，进一步优选为1:4:3；所述反应溶剂优选包括dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或几种，进一步优选为dmf和nmp的混合物，所述混合物中dmf和nmp的体积比优选为2～4:1～3，进一步优选为3:2。
63.在本发明中，步骤(3)中所述第一次环化反应的条件优选为：由碘和过氧化叔丁醇按照2～4g:70～75ml的用量比混合作为反应试剂，20～30℃下反应1～1.5h，进一步优选为：由碘和过氧化叔丁醇按照3g:73ml的用量比混合作为反应试剂，25℃下反应1.3h。
64.在本发明中，步骤(4)中所述第二次环化反应的条件优选为：由20～30vt％的双氧水作为反应试剂，20～30℃下反应0.8～1.2h，进一步优选为：由25vt％的双氧水作为反应
乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，色谱柱流速为85ml/min，采用梯度系统洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集谱图，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到普卡那肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得白色粉末状普卡那肽精肽，总收率为45％，纯度为99.7％。
78.实施例2
79.一种通过二次环化固相合成普卡那肽的方法，步骤如下：
80.(1)在7ml活化剂系统(diea:dmap(v:v)＝2:1)的存在下，将23gam树脂固相载体与18gfmoc-leu-oh偶联，得fmoc-leu-树脂；
81.(2)(2.1)采用去保护液(哌啶:dbu:dmf的体积比为2:2:97)脱除fmoc-leu-树脂上的fmoc保护基，得到h-leu-树脂；
82.(2.2)在偶联剂系统(偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂为bop/hobt/nmm，所述bop/hobt/nmm中bop、hobt和nmm的体积比为1:4:3；所述反应溶剂为dmf和nmp的混合物，所述混合物中dmf和nmp的体积比为3:2)的存在下，h-leu-树脂和fmoc保护且侧链保护的半胱氨酸偶联得到fmoc-cys(acm)-leu-树脂；
83.(2.3)重复步骤(2.1)、(2.2)，按照普卡那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，偶联的氨基酸顺序为：fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh；
84.(3)脱除cys(acm)的acm保护基，同时进行第一次环化反应，所述第一次环化反应的条件为：由碘和过氧化叔丁醇按照3g:73ml的用量比混合作为反应试剂，25℃下反应1.3h，得一环肽树脂；
85.(4)脱除cys(mob)上的mob保护基，同时进行第二次环化反应，所述第二次环化反应的条件为：由25vt％的双氧水作为反应试剂，25℃下反应1.1h，得二环肽树脂；
86.(5)采用去保护液(哌啶:dbu:dmf的体积比为2:2:97)脱fmoc保护基，裂解，所述裂解的具体步骤为：将上述所得二环肽树脂加入到100ml的三口圆底烧瓶中，将tfa、edt、h2o、tis按照93:2:2:2的体积比配置裂解液250ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1.2小时，离心，无水乙醚离心洗涤5次，真空干燥，得到白色普卡那肽粗肽，普卡那肽粗品纯度为89％；
87.(6)纯化、冻干：采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，流动相系统为0.1％tfa/水溶液-0.1％tfa/乙腈溶液，色谱柱流速为85ml/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得普卡那肽纯化中间体浓缩液；取普卡那肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤，收集滤液备用，采用高效液相色谱法进行转盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，色谱柱流速为85ml/min，采用梯度系统洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集谱图，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到普卡那肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得白色粉末状普卡那肽精肽，总
收率为50％，纯度为99.9％。
88.实施例3
89.一种通过二次环化固相合成普卡那肽的方法，步骤如下：
90.(1)在8ml活化剂系统(diea:dmap(v:v)＝3:1)的存在下，将25g2-ctc树脂固相载体与20gfmoc-leu-oh偶联，得fmoc-leu-树脂；
91.(2)(2.1)采用去保护液(哌啶:dbu:dmf的体积比为3:3:100)脱除fmoc-leu-树脂上的fmoc保护基，得到h-leu-树脂；
92.(2.2)在偶联剂系统(偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂为dic/hoat/diea，所述dic/hoat/diea中dic、hoat和diea的体积比为2:5:3；所述反应溶剂为dmso)的存在下，h-leu-树脂和fmoc保护且侧链保护的半胱氨酸偶联得到fmoc-cys(acm)-leu-树脂；
93.(2.3)重复步骤(2.1)、(2.2)，按照普卡那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，偶联的氨基酸顺序为：fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh；
94.(3)脱除cys(acm)的acm保护基，同时进行第一次环化反应，所述第一次环化反应的条件为：由碘和过氧化叔丁醇按照4g:75ml的用量比混合作为反应试剂，30℃下反应1.5h，得一环肽树脂；
95.(4)脱除cys(mob)上的mob保护基，同时进行第二次环化反应，所述第二次环化反应的条件为：由30vt％的双氧水作为反应试剂，30℃下反应1.2h，得二环肽树脂；
96.(5)采用去保护液(哌啶:dbu:dmf的体积比为3:3:100)脱fmoc保护基，裂解，所述裂解的具体步骤为：将上述所得二环肽树脂加入到100ml的三口圆底烧瓶中，将tfa、edt、h2o、tis按照95:3:3:3的体积比配置裂解液250ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1.2小时，离心，无水乙醚离心洗涤5次，真空干燥，得到白色普卡那肽粗肽，普卡那肽粗品纯度为88％；
97.(6)纯化、冻干：采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，流动相系统为0.1％tfa/水溶液-0.1％tfa/乙腈溶液，色谱柱流速为85ml/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得普卡那肽纯化中间体浓缩液；取普卡那肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤，收集滤液备用，采用高效液相色谱法进行转盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相c18，色谱柱流速为85ml/min，采用梯度系统洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集谱图，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到普卡那肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得白色粉末状普卡那肽精肽，总收率为48％，纯度为99.8％。
98.对比例1
99.除将活化剂系统改为dic:hobt:dmap(v:v)＝3:1:2之外，其余步骤、步骤参数均与实施例2保持一致，得普卡那肽粗品纯度为75％，最终普卡那肽总收率为41％，精肽纯度为
82.5％。
100.对比例2
101.除将第一次环化反应的条件改为：由碘和甲醇按照3g:73ml的用量比混合作为反应试剂，20℃下反应3h之外，其余步骤、步骤参数均与实施例2保持一致，得普卡那肽粗品纯度为73％，最终普卡那肽总收率为40％，精肽纯度为80.6％。
102.对比例3
103.除将去保护液改为哌啶:dmf的体积比为1:4之外，其余步骤、步骤参数均与实施例2保持一致，得普卡那肽粗品纯度为77％，最终普卡那肽总收率为42％，精肽纯度为84.2％。
104.由上述结果可知，与对比例1～3相比，采用本发明的方法及条件制备得到的普卡那肽总收率及精肽纯度均更高。
105.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。