一种去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法与流程

本发明涉及兽用生物制品，特别涉及一种去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法。

背景技术：

1、杂交瘤细胞(hybirdoma)是一种在制备单克隆抗体过程中，用在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞和在体外不能长期生存b淋巴细胞，在聚乙二醇(peg)作用下融合而成的细胞。所得的杂交瘤细胞承袭了两组亲代细胞的遗传特性，既保持了骨髓瘤细胞在体外迅速增殖传代能力，又继承了免疫细胞合成与分泌能力。杂交瘤技术在医学、农业、食品、生物技术工业和基础理论研究上的广泛应用。

2、细菌污染是细胞培养尤其是杂交瘤细胞培养中最为需要注意的事情，有效地控制分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的污染，已成为进行这项研究工作中常遇到的问题。大部分细胞被细菌污染以后会严重影响细胞的状态，导致细胞死亡。由于细菌耐药性的产生，传统应用双抗处理多难于凑效。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提供一种去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，旨在有效的净化细胞，得到特异性及纯净性良好的杂交瘤细胞。

2、为实现上述目的，本发明提出的一种去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，包括以下步骤：

3、将细菌污染的杂交瘤细胞离心弃上清，加入培养基重悬，得到重悬的杂交瘤细胞；

4、向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞；

5、将所述第一杂交瘤细胞转入无菌离心管内，离心弃上清，用培养基重悬细胞沉淀，细胞悬液铺于板孔中培养，得第二杂交瘤细胞；

6、将所述第二杂交瘤细胞进行亚克隆，得亚克隆细胞；

7、将所述亚克隆细胞扩大培养，得到净化的杂交瘤细胞。

8、可选地，在将细菌污染的杂交瘤细胞离心弃上清，加入培养基重悬，得到重悬的杂交瘤细胞的步骤中，所述培养基包括基础dmem高糖培养基。

9、可选地，在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞的步骤中，所述小鼠为10～15周龄。

10、可选地，在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞的步骤中，所述小鼠的体重为20g以上雌性小鼠。

11、可选地，在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞的步骤中，所述重悬的杂交瘤细胞的注射量为4×106～10×106个细胞/只。

12、可选地，在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞的步骤中，所述重悬的杂交瘤细胞的注射的量为0.4～0.6ml/只。

13、可选地，在将所述第一杂交瘤细胞转入无菌离心管内，离心弃上清，用培养基重悬细胞沉淀，细胞悬液铺于板孔中培养，得第二杂交瘤细胞的步骤中，所述培养基为含15～25％血清的dmem高糖培养基。

14、可选地，在将第二杂交瘤细胞进行亚克隆，得亚克隆细胞的步骤中，采用亚克隆板进行亚克隆，所述亚克隆板包括多个孔，每个孔的杂交瘤细胞含量为1～3个。

15、可选地，步骤在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞包括：在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，观察7～9天，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞。

16、可选地，在将所述第一杂交瘤细胞转入无菌离心管内，离心弃上清，用培养基重悬细胞沉淀，细胞悬液铺于板孔中培养，得第二杂交瘤细胞的步骤中，所述培养的时间为2～3天。

17、本发明技术方案通过将细菌污染的杂交瘤细胞，注射至小鼠腹腔，取出小鼠腹腔液体，经离心取细胞沉淀，培养基重悬后培养，然后进行亚克隆，及扩大培养，得到净化的杂交瘤细胞，通过本方案处理细菌污染的杂交瘤细胞，有效的净化细胞，得到特异性及纯净性良好的杂交瘤细胞。

技术特征：

1.一种去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，在将细菌污染的杂交瘤细胞离心弃上清，加入培养基重悬，得到重悬的杂交瘤细胞的步骤中，所述培养基包括基础dmem高糖培养基。

3.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞的步骤中，所述小鼠为10～15周龄。

4.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞的步骤中，所述小鼠的体重为20g以上雌性小鼠。

5.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞的步骤中，所述重悬的杂交瘤细胞的注射量为4×106～10×106个细胞/只。

6.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞的步骤中，所述重悬的杂交瘤细胞的注射的量为0.4～0.6ml/只。

7.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，在将所述第一杂交瘤细胞转入无菌离心管内，离心弃上清，用培养基重悬细胞沉淀，细胞悬液铺于板孔中培养，得第二杂交瘤细胞的步骤中，所述培养基为含15～25％血清的dmem高糖培养基。

8.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，在将第二杂交瘤细胞进行亚克隆，得亚克隆细胞的步骤中，采用亚克隆板进行亚克隆，所述亚克隆板包括多个孔，每个孔的杂交瘤细胞含量为1～3个。

9.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，步骤在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞包括：在向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，观察7～9天，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞。

10.如权利要求1所述的去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其特征在于，在将所述第一杂交瘤细胞转入无菌离心管内，离心弃上清，用培养基重悬细胞沉淀，细胞悬液铺于板孔中培养，得第二杂交瘤细胞的步骤中，所述培养的时间为2～3天。

技术总结
本发明公开一种去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法，其中，所述去除杂交瘤细胞中细菌污染的方法包括以下步骤：将细菌污染的杂交瘤细胞离心弃上清，加入培养基重悬，得到重悬的杂交瘤细胞；向小鼠的腹腔内注射所述重悬的杂交瘤细胞，得到实验小鼠，培养后，取出小鼠的腹腔内的液体，得第一杂交瘤细胞；将所述第一杂交瘤细胞转入无菌离心管内，离心弃上清，用培养基重悬细胞沉淀，细胞悬液铺于板孔中培养，得第二杂交瘤细胞；将第二杂交瘤细胞进行亚克隆，得亚克隆细胞；将所述亚克隆细胞扩大培养，得到净化的杂交瘤细胞。本发明提供的技术方案能够有效的净化细胞，得到特异性及纯净性良好的杂交瘤细胞。

技术研发人员：张敏,李建,石宝兰,漆世华,薛霜,朱薇,谢红玲,郑良益,牟林琳,秦红刚,李婷婷
受保护的技术使用者：国药集团动物保健股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12