抗新型冠状病毒Spike蛋白抗体及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程及免疫学领域，具体地说，涉及一种抗新型冠状病毒spike蛋白抗体及其应用。

背景技术：

1、新型冠状病毒(2019-ncov)是一种新的冠状病毒，与sars-cov同属于网巢病毒目冠状病毒科的β-cov，为一种不分节段的单股正链rna病毒，其每组基因组长度约30000个核苷酸左右。与中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)不同，新型冠状病毒是感染人类的冠状病毒家族中的第7个。根据基因序列同源性，新型冠状病毒基因组与sars具有80％的相似性，新型冠状病毒与mers-cov的基因序列有40％的相似性。

2、新型冠状病毒2019-ncov表现出典型的冠状病毒属结构(图4)，包括：5个未翻译区(utr)、复制酶复合体(orf1ab)、s基因、e基因、m基因、n基因、3个utr，以及几个未识别的非结构开放阅读框。

3、在冠状病毒中有一个关键的s蛋白(棘突蛋白，spike protein)，包含2个亚单位：s1和s2。s1能够促进病毒与宿主细胞受体的结合，其含有一个重要的c端rbd结构域，正是这个区域负责和受体结合。新型冠状病毒rbd结构域与sars有高度的同源性。其中sars感染的5个关键位点中，有1个被新型冠状病毒保留，其余4个有氨基酸的替换和变化。

4、冠状病毒的s蛋白(spike)组合成一个三聚体，约含有1300个氨基酸，属于第一类膜融合蛋白(class i viral fusion protein)，同类的病毒膜融合蛋白还包括hiv的env蛋白，流感的ha蛋白，以及埃博拉病毒的gp蛋白等。s蛋白决定了病毒的宿主范围和特异性，也是宿主中和抗体的重要作用位点。同时也是疫苗设计的关键靶点。

5、与其它第一类病毒膜融合蛋白类似，s蛋白含有两个亚基(subunit)，s1和s2。s1主要包含有受体结合区(receptorbinding domain，rbd)，负责识别细胞的受体。s2含有膜融合过程所需的基本元件，包括一个内在的膜融合肽(fusion peptide)，两个7肽重复序列(heptad repeat，hr)，一个富含芳香族氨基酸的膜临近区域(membrane proximalexternal region，mper)，以及跨膜区(transmembrane，tm)。s1蛋白可进一步分成两个区域(domain)，即n-端区域(n-terminal domain,ntd)和c-端区域(c-terminal domain，ctd)，其中ntd的构象与galectin蛋白非常相似。大部分的冠状病毒s蛋白的rbd都位于ctd，例如sars病毒和中东呼吸道综合症病毒(middle east respiratory syndrome，mers)等。只有少部分β冠状病毒的rbd则位于ntd，例如小鼠肝炎病毒(mouse hepatitisvirus,mhv)。另外，牛冠状病毒(bovine coronavirus,bcov)和人冠状病毒oc43的ntd能结合特异的糖分子(唾液酸等)，它们也参与了冠状病毒的入侵过程。同一家族病毒包膜蛋白需要两个不同的区域识别宿主受体，并有效介导病毒与细胞的膜融合过程。这是冠状病毒s蛋白与其它类病毒膜融合蛋白的重要区别之一。

6、目前已发现的冠状病毒受体主要包括以下几种：氨基肽酶n(animopeptidase n，apn)，血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme ii，ace2)，二肽基肽酶4(dipeptidylpeptidase 4,dpp4)，以及ceacam1(carcinoembryonicantigen-related celladhesion molecule)。其中，具有种属特异性的apn蛋白是人冠状病毒229e，猫冠状病毒(fcov)和猪冠状病毒tgev的受体。人类ace2是sars病毒和nl63的受体。人类dpp4是mers病毒的受体。小鼠ceacam1蛋白的α亚型是mhv的受体。许多冠状病毒rbd与宿主受体结合的复合物晶体结构已经获得解析，主要包括sars-rbd-ace2复合物,nl63-rbd-ace2复合物，mers-rbd-dpp4复合物，hku4-rbd-dpp4复合物，和mhv-rbd-mceacam1α复合物晶体结构。

7、由新型冠状病毒2019-ncov感染以及由其感染所致相关疾病目前没有相应的疫苗和特异性药物，因此开发2019-ncov诊疗药物成为当务之急。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种抗新型冠状病毒spike蛋白抗体及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种抗新型冠状病毒spike蛋白抗体或其活性片段，其重链可变区的cdr1包含如seq id no:1所示的氨基酸序列或由其组成，重链可变区的cdr2包含如seq id no:2或3所示的氨基酸序列或由其组成，重链可变区的cdr3包含如seq id no:4-7任一所示的氨基酸序列或由其组成；其轻链可变区的cdr1包含如seqid no:8-12任一所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区的cdr2包含如seq id no:13-16所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区的cdr3包含如seq id no:17-19任一所示的氨基酸序列或由其组成。

3、本发明提供的抗体可变区氨基酸序列，其模式为：

4、fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。本发明中，fr和cdr的区域划分基于kabat命名系统。在此，fr1～fr4代表4个框架区域，cdr1～cdr3代表3个高变区。fr1～fr4可以是从恒定区序列分离而来(例如人免疫球蛋白轻重链类、亚类或亚家族最常用的氨基酸)，也可以是从个人抗体框架区分离而来或从不同的框架区基因组合而来。

5、本发明的抗新型冠状病毒spike蛋白抗体，其为：

6、i)、重链可变区包含如seq id no:20-25任一所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:26-33任一所示的氨基酸序列或由其组成；

7、ii)、i)的抗体经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由i)衍生的抗体；

8、iii)、与i)的抗体具有70％、80％、85％、90％或97％以上序列同源性且具有同等功能的由i)衍生的抗体。

9、优选cs1～cs8中的任一条抗体：

10、cs1：重链可变区包含如seq id no:20所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:26所示的氨基酸序列或由其组成；

11、cs2：重链可变区包含如seq id no:21所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:27所示的氨基酸序列或由其组成；

12、cs3：重链可变区包含如seq id no:22所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:28所示的氨基酸序列或由其组成；

13、cs4：重链可变区包含如seq id no:22所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:29所示的氨基酸序列或由其组成；

14、cs5：重链可变区包含如seq id no:23所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:30所示的氨基酸序列或由其组成；

15、cs6：重链可变区包含如seq id no:22所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:31所示的氨基酸序列或由其组成；

16、cs7：重链可变区包含如seq id no:24所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:32所示的氨基酸序列或由其组成；

17、cs8：重链可变区包含如seq id no:25所示的氨基酸序列或由其组成，轻链可变区包含如seq id no:33所示的氨基酸序列或由其组成。

18、第二方面，本发明提供上述抗新型冠状病毒spike蛋白抗体或其活性片段经改造得到的抗体，所述抗体包括但不限于单链抗体、fab、微型抗体、嵌合抗体、全抗体免疫球蛋白igg1、igg2、iga、ige、igm、igg4或igd等。

19、本发明提供的抗新型冠状病毒spike蛋白抗体以1nm-50nm的亲和力结合于新型冠状病毒(2019-ncov)spike蛋白。该抗体抑制新型冠状病毒spike蛋白结合人ace2。

20、第三方面，本发明提供编码上述抗体的基因。

21、考虑到密码子的简并性，编码本发明所述抗体的基因可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

22、第四方面，本发明提供含有所述基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系等。

23、第五方面，本发明提供所述抗体、编码抗体的基因或含有基因的生物材料的以下任一应用：

24、1)在制备以新型冠状病毒spike蛋白为靶标的疾病治疗药物或组合物中的应用；优选所述药物为新型冠状病毒2019-ncov spike蛋白引起疾病的诊断和治疗药物；

25、2)在制备预防或治疗新型冠状病毒2019-ncov感染或由其感染所致相关疾病的药物或组合物中的应用；

26、3)在制备预防或治疗新型冠状病毒2019-ncov感染或由其感染所致相关疾病的细胞治疗药物或组合物中的应用；

27、4)在制备新型冠状病毒2019-ncov检测及诊断试剂或试剂盒中的应用；

28、5)在制备以新型冠状病毒spike蛋白为靶标的car-t疗法的相关制剂中的应用；

29、6)用于新型冠状病毒2019-ncov的检测(含非诊断目的)；

30、7)用于预防或治疗新型冠状病毒2019-ncov感染或由其感染所致相关疾病；

31、8)用于car-t治疗。

32、第六方面，本发明提供含有所述抗新型冠状病毒spike蛋白抗体或其活性片段的药物或组合物。

33、第七方面，本发明提供含有所述抗新型冠状病毒spike蛋白抗体或其活性片段的检测试剂或试剂盒。

34、本发明提供的抗体为全抗体或各种其他形式的基因工程抗体。例如，抗新型冠状病毒spike蛋白抗体可以是全抗体或抗体片段。抗体分子本身可用于治疗和诊断。抗体可以被标记、交联或偶联及与其他蛋白或多肽分子融合表达形成复合物(如细胞毒性物质、放射性毒素和/或化学分子等)用于诊断和治疗。

35、进一步地，本发明提供编码抗体的独立基因，表达载体，载体转染宿主细胞相关控制技术及宿主细胞，抗体表达流程及在细胞培养上清中回收抗体。本发明同样提供含有抗体的组分和药理学上可接受的递送分子或溶液。治疗用组分为无菌，可低温冻干。

36、本发明提供一种抗新型冠状病毒(2019-ncov)spike蛋白的抗体，该抗体也通过阻碍新型冠状病毒(2019-ncov)spike蛋白与ace2结合发挥作用。新型冠状病毒(2019-ncov)spike蛋白拮抗剂所具有的干扰功能均落入本发明的保护范围。

37、本发明中seq id no:1-33所示序列包括“保守序列修饰”，即不明显影响和改变所述抗体或含有所述氨基酸序列抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。所述保守序列修饰包括核苷酸或氨基酸替换、添加或缺失。本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自于同一侧链家族的另一种氨基酸残基代替人抗新型冠状病毒(2019-ncov)spike蛋白抗体中的非必须氨基酸残基。

38、含有本发明特定氨基酸组成的抗体包括基本上由经保守序列修饰的相似序列编码的，或含有经保守序列修饰的相似序列的抗体，均落入本发明的保护范围。

39、本发明提供一种双特异性或多特异性分子，包含本发明提供的上述抗体或抗体的抗原结合部位的分子。

40、本发明提供一种抗体与其他蛋白和/或多肽的融合蛋白，包含本发明提供的上述抗体和具有某种功能的其他蛋白或多肽分子的复合物。

41、进一步地，所述的融合蛋白为将抗体基因与免疫毒素或细胞因子基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。

42、本发明提供的新型冠状病毒(2019-ncov)spike蛋白抗体具有良好的治疗应用前景，主要表现为与新型冠状病毒(2019-ncov)spike蛋白具有特异性结合活性。该抗体经elisa检测及流式细胞仪检测，结果表明靶标特异性良好。

43、本发明利用基因工程和噬菌体表面展示文库技术，从非免疫的全人源序列的单链抗体库中筛选出抗新冠病毒s蛋白的特异性抗体。经octet blitz测定，它们与病毒s蛋白的表观亲和力为1nm-50nm之间，而且对新冠病毒s蛋白与人受体ace2的结合有抑制作用，表明本发明的抗病毒s蛋白抗体具有良好地结合s蛋白的能力及潜在的中和抑制作用。本发明为研发针对新冠病毒(2019-ncov)的诊断试剂、预防和治疗抗体药物，以及其它疾病如冠状病毒引起的肺炎治疗等提供了特异性抗体候选分子。