一种阿立哌唑人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物化工，具体涉及一种阿立哌唑人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

背景技术：

1、阿立哌唑，英文名为aripiprazole,是第二代抗精神分裂症药物，对神经系统具有双向调节作用，是da递质的稳定剂。用于治疗各类型的精神分裂症。国外临床试验表明，本品对精神分裂症的阳性和阴性症状均有明显疗效，也能改善伴发的情感症状，降低精神分裂症的复发率。

2、报道的较常见(>10％)的药物不良反应有：焦虑、头痛、失眠、头晕、思睡、恶心呕吐、尿失禁、颈硬；偶见(1％～10％)的有：静坐不能、便秘、皮疹、咳嗽、鼻塞；少见(<1％)的有：震颤、发热、骨痛、肌痛、视物模糊。

3、目前，对阿立哌唑常用检测分析方法主要有：气相色谱法(gc)、气-质联用法(gc-ms)、高效液相色谱法(hplc)、液-质联用法(lc-ms)等。这些仪器分析方法具有极高的灵敏度和精密度，但需要昂贵的仪器、设备和经过专门培训的技术人员，不适用于批量样品的筛选检测和现场即时检测。近年发展起来的免疫检测法具有操作简便、高效、灵敏、适合大规模检测等优点，已被广泛应用于各类违禁品等的检测。而要建立阿立哌唑的免疫检测方法，必须获得具有抗原活性的阿立哌唑完全抗原。

技术实现思路

1、本发明提供了一种阿立哌唑人工半抗原，该阿立哌唑人工半抗原是利用阿立哌唑的一种代谢物作为前体，通过化学修饰制得的，它最大程度地保留了阿立哌唑的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。

2、为实现上述技术目的，本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明的第一个目的是提供一种阿立哌唑人工半抗原，其分子结构式如式ⅰ所示：

4、

5、本发明第二个目的在于提供所述阿立哌唑人工半抗原的制备方法，所述方法包括以下步骤：

6、(1)式ii所示的羟基阿立哌唑和三乙胺、二碳酸二叔丁酯进行酰化反应，制得式a所示的化合物；

7、(2)式a所示的化合物和溴乙酸乙酯和氢化钠进行取代反应，制得式b所示的化合物；

8、(3)式b所示的化合物在三氟乙酸中脱保护基，制得式c所示的化合物；

9、(4)式c所示的化合物和碱溶液进行水解反应，再调节ph值至酸性，制得式i所示的阿立哌唑半抗原。

10、所述方法的反应式如下：

11、

12、式ii所示的羟基阿立哌唑为阿立哌唑的代谢产物且两者具有相同的特征官能团，因此可使用羟基阿立哌唑进行阿立哌唑人工半抗原的合成。

13、所述步骤(1)中，所述羟基阿立哌唑、三乙胺、二碳酸二叔丁酯的物质的量之比优选为1:2～2.5:1.05～1.2；

14、所述步骤(2)中，所述式a所示的化合物、溴乙酸乙酯、氢化钠的物质的量之比优选为1:2～2.2:1.5～2；

15、步骤(2)的反应温度优选为加热至回流反应

16、所述步骤(4)中的碱溶液优选为naoh水溶液。

17、进一步，所述方法优选按以下步骤进行：

18、(1)将式ii所示的羟基阿立哌唑溶于四氢呋喃中，置于0℃的冰水浴中，加入三乙胺，再逐滴滴加二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液，室温搅拌反应4～5小时；反应结束后将反应液减压蒸干得式a所示的化合物；

19、所述羟基阿立哌唑、三乙胺、二碳酸二叔丁酯的物质的量之比为1:2～2.5:1.05～1.2；

20、所述四氢呋喃的总体积用量以羟基阿立哌唑的物质的量计为10～30ml/mmol；

21、(2)将式a所示的化合物溶于n,n-二甲基甲酰胺中，再加入溴乙酸乙酯和氢化钠，65℃油浴下回流搅拌反应18～20小时，反应结束后将反应液减压蒸干，用水-二氯甲烷萃取，取有机相，干燥、浓缩得式b所示的化合物；

22、所述式a所示的化合物、溴乙酸乙酯、氢化钠的物质的量之比为1:2～2.2:1.5～2；

23、所述n,n-二甲基甲酰胺的体积用量以式a所示的化合物的物质的量计为10～30ml/mmol；

24、(3)将式b所示的化合物溶于三氟乙酸和二氯甲烷中，室温搅拌反应5～6小时，反应结束后，将反应液减压蒸干得式c所示的化合物；

25、所述三氟乙酸的用量为过量，一般三氟乙酸的体积用量以式b所示的化合物的质量计为10～20ml/g；

26、所述二氯己烷的体积用量以式b所示的化合物的质量计为10～20ml/g；

27、(4)将式c所示的化合物溶于甲醇中，再加入四氢呋喃和1n的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应3～5小时，反应结束后调节ph＝3，用水-乙酸乙酯萃取，取有机相，干燥、浓缩得到固体产物，再经薄层色谱纯化，制得式i所示的阿立哌唑半抗原；

28、所述1n的氢氧化钠水溶液的体积用量一般以式c所示的化合物的质量计为35～50ml/g；

29、所述甲醇的体积用量一般以式c所示的化合物的质量计为15～30ml/g；

30、所述四氢呋喃的体积用量一般以式c所示的化合物的质量计为10～25ml/g；

31、一般用1n的盐酸调溶液ph＝3；

32、所述薄层色谱的层析液为95vol％乙醇、1,4-二氧六环、二氯甲烷、氨水的体积比为8：1：10：1的混合液。

33、通过上述方法，在阿立哌唑半抗原ⅰ的羧基上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能较大程度地保留阿立哌唑的特征结构，且不占有阿立哌唑的活性位点，制得的对应的人工抗原与抗体有更高的特异性。

34、本发明还提供一种阿立哌唑人工抗原，其分子结构式如式ⅲ所示：

35、

36、式(ⅲ)中，bgg为牛丙种球蛋白。

37、本发明还提供所述阿立哌唑人工抗原ⅲ的制备方法，包括：将式i所示的阿立哌唑人工半抗原与牛丙种球蛋白通过活泼酯法结合，制得式iii所示的阿立哌唑人工抗原。

38、进一步，采用活泼酯法制备式iii所示的阿立哌唑人工抗原时，所述方法包括以下步骤：

39、(a)将式i所示的阿立哌唑人工半抗原、n,n'-二环己基碳二亚胺、n-羟基丁二酰亚胺按物质的量之比为1:1～2:1～2混合，在20～30℃下搅拌反应18～20小时，反应结束后离心取上清液；

40、反应中优选加入n,n-二甲基甲酰胺溶剂；所述n,n-二甲基甲酰胺的体积用量一般以式i所示的阿立哌唑人工半抗原的物质的量计为20～40ml/mmol。

41、(b)将所述上清液滴加到牛丙种球蛋白溶液中，混匀后将所得混合液置于3～5℃下静置过夜(通常静置15～24小时)，经透析、离心取上清液，制得所述式iii所示的阿立哌唑人工抗原。

42、进一步，本发明中所述牛丙种球蛋白溶液是将牛丙种球蛋白溶于0.01m、ph＝7.2-7.4的pbs缓冲液中制成的。

43、所述步骤(b)中，所述牛丙种球蛋白溶液的浓度为5mg/ml，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5。

44、本发明选用牛丙种球蛋白(bgg)为白色或乳白色粉末，无味或稍有特异香气和味道，易溶于水。其水溶液遇酸会产生酪蛋白沉淀。它作为大分子载体，具有以下优点：①牛丙种球蛋白能够结合更多的阿立哌唑人工半抗原，免疫原性较好；②从实验看，牛丙种球蛋白与阿立哌唑人工半抗原的结合更稳定；③用牛丙种球蛋白与阿立哌唑人工半抗原结合后形成的阿立哌唑人工抗原，经动物免疫得到的抗阿立哌唑抗体的特异性更好。

45、本发明还提供了所述阿立哌唑人工抗原在制备抗阿立哌唑抗体中的应用。

46、本发明还提供一种抗阿立哌唑抗体，是由所述阿立哌唑人工抗原经动物免疫得到的、可与阿立哌唑发生特异性免疫反应的球蛋白。

47、本发明还提供所述抗阿立哌唑抗体在检测阿立哌唑中的应用。

48、本发明还可提供一种用于检测阿立哌唑的试剂，所述试剂包括所述抗阿立哌唑抗体。

49、本发明还提供一种用于检测阿立哌唑的试剂盒，所述试剂盒包括所述抗阿立哌唑抗体。

50、试验发现，将式ⅲ所示的阿立哌唑人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1:70000，结果表明本发明的阿立哌唑人工抗原可经过免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗阿立哌唑抗体，该抗阿立哌唑抗体可用于阿立哌唑的免疫检测和分析。

51、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

52、本发明的阿立哌唑人工半抗原最大程度地保留了阿立哌唑的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的阿立哌唑人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗阿立哌唑抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价可以满足需要，可用于对阿立哌唑进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。