一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用。


背景技术：

2.哺乳动物细胞表达平台是生产治疗性重组蛋白药物的主要系统，中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovary,cho)因其具备蛋白折叠和翻译后修饰功能，既可贴壁生长，也可悬浮培养，具有高效的基因扩增和表达能力，已经成为生物制药重要的表达和生产系统，并广泛应用于抗体、基因重组蛋白药物和病毒疫苗等产品的研发和工业化生产中。在生物制药工业中，开发细胞培养基和优化培养条件是获得高产量和高质量重组蛋白药物的关键。
3.外泌体是由不同细胞分泌的直径为30～150nm的细胞外脂质双层囊泡，含有蛋白质、核酸、脂质和mirna等，不仅能够调节细胞生物学活性，还参与细胞间通讯和机体的生理代谢过程。研究表明，外泌体能够调控包括炎症、细胞分化和细胞凋亡等一系列生物学活动。然而目前，对外泌体的应用更多的体现在医学技术领域，例如，将外泌体用于高血压及相关疾病的诊断，用于烧伤、皮肤溃疡、创伤等受损皮肤的修复治疗，用于改善肤质、修复衰老中毒皮肤等。尚未见将外泌体添加到细胞培养基的相关研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用。本发明采用差速超速离心法提取中国仓鼠卵巢细胞的外泌体，通过简单操作可以获得高产量、高纯度的外泌体，将该外泌体作为细胞培养基补充添加剂，能够提高重组蛋白的表达水平，提高重组蛋白药物的生产效率和经济效益。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体在提高重组蛋白表达水平中的应用。
7.优选的，所述提高重组蛋白表达水平的方法为，将所述中国仓鼠卵巢细胞外泌体作为培养基补充添加剂，培养表达重组蛋白的细胞。
8.优选的，所述中国仓鼠卵巢细胞外泌体在培养基中的终浓度为(5～10)
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105particles/ml。
9.本发明还提供了一种上述中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法，包括如下步骤：
10.(1)使用基础培养基培养中国仓鼠卵巢细胞，待细胞密度达到70～90％时消化细胞，将细胞转移至条件培养基中培养2～3天后，收集细胞培养上清液；
11.(2)将步骤(1)收集的细胞培养上清液于0～4℃下，200～400g离心8～12min，以去除细胞沉淀后，收集上清液；
12.(3)将步骤(2)收集的上清液于0～4℃下，1500～2500g离心8～12min，以去除死细胞后，收集上清液；
13.(4)将步骤(3)收集的上清液于0～4℃下，9000～12000g离心20～40min，以去除细
胞碎片后，收集上清液；
14.(5)将步骤(4)收集的上清液过滤以去除细胞微粒后，收集上清液；
15.(6)将步骤(5)收集的上清液于0～4℃下，70000～150000g离心60～80min，以去除杂蛋白后，收集沉淀；
16.(7)用pbs洗涤步骤(6)收集的沉淀，70000～150000g离心60～80min，弃上清，得到所述中国仓鼠卵巢细胞外泌体。
17.优选的，所述中国仓鼠卵巢细胞为cho-s细胞或cho-k1细胞。
18.优选的，所述基础培养基为包含血清的dmem/f12培养基；所述血清在所述基础培养基中的体积分数为8～12％。
19.优选的，所述条件培养基为包含无外泌体血清的dmem/f12培养基；所述无外泌体血清在所述条件培养基中的体积分数为8～12％。
20.优选的，所述转移的细胞与所述条件培养基的比例为2
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106个：8～15ml。
21.优选的，所述过滤为使用0.2～0.4μm微孔滤膜过滤。
22.本发明提供了一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用。本发明采用差速超速离心法提取中国仓鼠卵巢细胞的外泌体，逐步去除细胞沉淀、死细胞、细胞碎片后，通过过滤去除细胞微粒，再进行离心去除杂蛋白，从而可以提高外泌体产率及纯度。本发明的提取方法操作简便、外泌体产量高，提取得到的中国仓鼠卵巢细胞外泌体作为培养基补充添加剂，能够显著提高重组蛋白的表达水平，提高重组蛋白药物的生产效率，提高经济效益。
附图说明
23.图1为实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体的形态结构图。
24.图2为对比例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体的形态结构图。
25.图3为实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体的浓度与粒径分布图。
26.图4为实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体标志蛋白的westernblot检测结果图。
27.图5为试验例3中不同浓度的中国仓鼠卵巢细胞外泌体作用下的重组蛋白hsa表达水平。
具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
29.实施例1
30.本实施例提供了一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法，具体过程如下：
31.(1)使用超高速离心机将常规胎牛血清(购自维森特生物技术有限公司，货号086-150)在4℃、100000g条件下离心12h，0.2μm滤膜过滤，得到无外泌体血清；
32.(2)将90％的dmem/f12培养基与10％的常规胎牛血清混合，制成基础培养基；将90％的dmem/f12培养基与10％的无外泌体血清混合，制成条件培养基；用基础培养基培养中国仓鼠卵巢细胞cho-s细胞(购自gibco公司)，待细胞密度达到80％时消化细胞，按照2
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106细胞/皿的密度接种到10cm细胞培养皿中，使用10ml的条件培养基培养细胞3天，收集细胞培养上清液；
33.(3)将步骤(2)收集的细胞培养上清液于4℃下，300g离心10min以去除细胞沉淀，收集上清液；
34.(4)将步骤(3)收集的上清液于4℃下，2000g离心10min以去除死细胞，收集上清液；
35.(5)将步骤(4)收集的上清液于4℃下，10000g离心30min以去除细胞碎片，收集上清液；
36.(6)将步骤(5)收集的上清液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，以去除细胞微粒，收集上清液；
37.(7)将步骤(6)收集的上清液于4℃下，100000g离心70min以去除杂蛋白，收集沉淀；
38.(8)用pbs洗涤步骤(7)收集的沉淀，100000g离心70min，弃上清，得到中国仓鼠卵巢细胞外泌体。
39.将提取得到的中国仓鼠卵巢细胞外泌体用100μlpbs重悬，得到外泌体悬液，于-80℃下保存。
40.对比例1
41.按照实施例1的方法，省略步骤(6)的微孔滤膜过滤，其余步骤和参数与实施例1相同，得到中国仓鼠卵巢细胞外泌体，将提取得到的中国仓鼠卵巢细胞外泌体用100μlpbs重悬，得到外泌体悬液，于-80℃下保存。
42.试验例1
43.1.采用透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,tem)观察实施例1和对比例1的外泌体形态，具体过程如下：
44.分别吸取20μl实施例1和对比例1的外泌体悬液滴于载样铜网上，室温吸附5min，用滤纸从滤网侧边吸干液体；用2％磷钨酸溶液滴于铜网上，室温负染5min；滤纸吸干负染液后室温晾干，使用透射电子显微镜观察拍照，观察实施例1和对比例1的外泌体的形态特征，结果如图1和图2所示，图1为实施例1的外泌体形态特征，图2为对比例1的外泌体形态特征。
45.从图1和图2可以看出，实施例1的外泌体干净无杂质，而对比例1的外泌体含有蛋白类杂质和囊泡碎片。表明，实施例1的方法提取的外泌体纯度更高，且实施例1的外泌体具有完整的双层囊膜超微结构，一侧为凹陷的半球形，呈杯状结构。
46.2.纳米颗粒跟踪分析(nanoparticletrackinganalysis,nta)鉴定实施例1和对比例1的外泌体悬液的浓度，具体过程如下：
47.采用德国particlemetrix公司zetaview纳米颗粒跟踪分析仪对实施例1和对比例1的中国仓鼠卵巢细胞外泌体悬液进行nta检测。用聚苯乙烯微球校准仪器，pbs清洗样本池，用pbs稀释实施例1和对比例1的外泌体悬液，用注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪中，根据其布朗运动计算浓度及流体力学直径。经检测实施例1的外泌体悬液的浓度为3.1
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10
10
particles/ml，对比例1的外泌体悬液的浓度为1.8
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10
10
particles/ml。表明，实施例1的方法提取的外泌体悬液浓度更高，外泌体产量更高。
48.其中，实施例1的外泌体悬液的浓度及粒径分布图如图3所示。从图3可以看出，实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体粒径在100nm左右，符合经典外泌体粒径30～150nm的标准。
49.综上，与对比例1相比，实施例1的方法提取的外泌体纯度更高，提取率更高，且无杂蛋白或囊泡碎片等杂质。因此，采用实施例1的外泌体进行后续试验。
50.试验例2
51.检测实施例1的外泌体的蛋白浓度以及标志蛋白，具体过程如下：
52.1.吸取50μl外泌体蛋白裂解液加入等体积的实施例1的外泌体悬液中，冰上裂解30min，于4℃、12000g条件下离心10min，吸取上清加入新的ep管中，使用bca蛋白浓度试剂盒测定外泌体蛋白浓度。结果显示，实施例1的中国仓鼠卵巢细胞外泌体的蛋白浓度为2.05mg/ml。
53.2.制备sds-page胶，westernblot检测外泌体标志蛋白，包括cd63、cd81和tsg101，检测结果如图4所示。从图4可以看出，实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体可检测到cd63、cd81和tsg101蛋白的表达。
54.试验例3
55.验证实施例1制备的中国仓鼠卵巢细胞外泌体在提高重组蛋白表达水平中的用途，具体过程如下：
56.以重组蛋白hsa表达水平为例，使用dmem/f12完全培养基培养hsa稳定表达cho细胞株至对数生长期。将对数生长期的hsa稳定表达cho细胞株接种到六孔培养板中，每孔加入3mlcho细胞无血清培养基，使各孔的细胞密度为5
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105个细胞/ml。设置对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4，每组设置3个复孔。将培养板置于37℃，5％co2培养箱120rpm悬浮培养。培养至第四天时，于实验组1～4的培养基中加入实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体，使实验组1的培养基中的外泌体浓度为2.5
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105particles/ml，实验组2的培养基中的外泌体浓度为5.0
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105particles/ml，实验组3的培养基中的外泌体浓度为7.5
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105particles/ml，实验组4的培养基中的外泌体浓度为10.0
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105particles/ml。对照组为空白对照。作用24h后，收集细胞培养上清，加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，wb检测重组蛋白hsa的表达情况。检测结果如图5所示。
57.从图5可以看出，与对照组相比，外泌体浓度为5.0
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105、7.5
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105、10
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105particles/ml时，hsa表达水平分别提高了1.47、1.54和1.74倍。说明本发明实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体能够显著提高重组蛋白表达量。
58.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。