白茅种子内生真菌DF101及其应用

白茅种子内生真菌df101及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株种子内生真菌（septoriella phragmitis）df101及其在重金属污染的生物修复中的应用。


背景技术：

2.由于矿山开采与冶炼、化肥农药的大量使用、农田污灌以及固体废弃物弃置等人类活动，土壤重金属污染越来越严重。我国土壤总超标率为16.1%，其中镉、汞、砷等8种重金属超标点位数占全部超标点位的82.8%。在各种重金属污染物中，镉（cd）因其强大的生物毒性和高转移风险而被确定为最重要的污染物之一。土壤中过量的重金属不仅会抑制作物生长，还会通过食物链产生毒性放大作用，严重威胁着人类健康。因此，修复土壤中的重金属污染已迫在眉睫。
3.在所有修复方法中，植物修复因其原位、环保、费用低、操作简单而在重金属污染土壤修复中展现出较好的应用前景。然而，在实际应用中，植物修复仍存在修复效率低、费时等问题，植物-微生物联合修复有望解决这些问题。因为许多微生物能通过产生植物生长素、改善植物的营养吸收、改变土壤中重金属的生物有效性等促进植物在重金属污染环境的生长，从而增加其生物量，提高修复效率。
4.种子是植物的繁殖器官，种子内定殖有一定数量的内生菌。研究表明，许多作物的种子，包括水稻、小麦、棉花、玉米等都含有内生菌，内生菌不但可以促进宿主植物的生长发育还可以保护其免受病原体的侵害。由于部分种子内生菌是通过种子进行垂直传播并成为新生植物体内最早定殖的微生物，因而对宿主植物来说，种子内生菌具有更重要的生态学意义。例如，mastretta等证明了接种抗镉内生菌的烟草种子可以在镉胁迫下生长，该种子内生菌降低了镉对烟草的重金属毒性；johnston-monje 等发现来源于玉米种子的内生菌，可通过固氮、分泌铁载体等功能刺激宿主植物，使其能够快速适应包括重金属胁迫在内的恶劣环境；truyens等研究表明，在镉胁迫下拟南芥（arabidopsis thaliana）连续几代种子内生菌比无镉胁迫的种子内生菌具有更显著的重金属抗性。这些研究表明某些内生菌可以垂直传播给下一代并赋予其重金属抗性，对植物适应重金属胁迫环境具有重要意义。种子内生菌在提高植物-内生菌联合修复重金属土壤污染效率方面显示出巨大应用前景。


技术实现要素：

5.本发明提供了一株植物种子内生真菌df101，分类命名为septoriella phragmitis，其分离自白茅（imperata cylindrica l.）种子，其于2022年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40427，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
6.本发明另一目的是提供上述植物种子内生真菌df101的新用途，即将其应用在镉污染的生物修复中，本发明白茅种子内生真菌df101具有产iaa、产铁载体的能力、较高的解磷能力，具有较强的镉耐受性，在镉胁迫下能促进种子萌发、提高幼苗存活率、增强其镉抗
性。
7.为了实现以上目的，本发明采取以下技术方案：1、将采集自云南省建水市普雄乡的白茅（i. cylindrica）植物样品置于阳光下晾晒风干至种子可以自然脱落，然后将种子样品置于4℃冰箱中保存备用；2、从植物样品中随机挑选出种子600粒，按下列程序进行表面消毒：体积浓度75%的乙醇表面消毒2次，每次时间为1min，然后用无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分。之后将表面消毒后的种子贴到pda平板上，25℃培养，隔天观察，培养期间见组织块周围有真菌长出，则挑取、纯化；同时，通过漂洗液检验法检验种子表面消毒是否彻底；3、配制含不同cd
2+
浓度的pdb培养基，分装至锥形瓶中，将分离得到的内生菌株挑取大小均匀的菌丝体于锥形瓶中，每个浓度三次重复，置于28℃的恒温水平摇床上于135 rpm振荡培养6d后，观察不同浓度下菌落的长势；选出对cd
2+
具有较强抗性的菌株，保存于pda斜面上，并将该真菌命名为df101；4、菌株df101的鉴定（1）df101形态学特征：培养初期菌落边缘整齐呈白色，长有茂密的灰色菌丝，呈棉絮状，近圆形，不透明，6d后菌落开始变成黄褐色；（2）分子鉴定：采用mobio powersoil
®ꢀ
dna试剂盒提取该菌株总dna，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与ncbi上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为septoriella phragmitis ；该菌株保存和活化所用培养基均为pda培养基；5、本发明将从白茅中分离得到的种子内生真菌s. phragmitisdf101进行种子萌发实验，探讨其对种子萌发的影响，即进行了种子内生真菌s. phragmitis df101接种对种子在重金属胁迫下萌发的影响研究，为植物-微生物联合修复提供真菌菌种和理论研究依据。
8.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的种子内生真菌s. phragmitis df101来源于白茅种子，其具有溶磷、产iaa、产铁载体能力，较好的耐镉能力，且通过简单液体发酵即可获得大量的菌丝体，菌体易获取，成本低廉，拥有商业化应用的潜能；在镉胁迫下能促进种子的萌发，能够显著提高种子在重金属环境中的萌发率，提高其生存能力，增强其镉抗性，对重金属污染土壤的修复有重要意义。
附图说明
9.图1为白茅种子内生真菌df101在pda培养基上的菌落形态（图a：正面，b：背面）；图2为磷标准溶液的标准工作曲线；图3为iaa标准溶液的标准工作曲线；图4为s. phragmitis df101解磷、产iaa能力测定结果；图5为对不同浓度镉胁迫下，s. phragmitis df101接种（e+）和未接种（ck）下土荆芥的种子萌发率。
具体实施方式
10.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施；下述实施例中铬天青s（cas）检测液的配制为：溶液a：称取60.5mg铬天青溶解于50ml去离子水中，加入10ml fe
3+
溶液（含有1mm六水氯化铁、10mm稀盐酸）搅拌混匀；溶液b：将72.9mg十六烷基三甲基溴化胺溶于40ml去离子水；将溶液a缓慢倒入溶液b中搅拌均匀，即得cas蓝色检测液。
11.实施例1：种子内生真菌s. phragmitis df101的分离、筛选与鉴定（1）采集云南省建水市普雄乡的白茅样品，将植物样品置于阳光下晾晒风干至种子可以自然脱落，然后将种子样品置于4℃冰箱中保存备用；（2）内生菌的分离：从种子样品中随机挑选出种子600粒，用体积浓度75%的乙醇表面消毒2次，每次时间为1min，然后用无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分。之后将表面消毒后的种子贴到pda平板上（90mm），每皿6粒，25℃培养60d，隔天观察，培养期间见组织块周围有真菌长出，则挑取、纯化；同时，通过漂洗液检验法检验种子表面消毒是否彻底；（3）镉抗性菌株的筛选：配制含cd
2+
0、100、200、400mg/l的pdb培养基，分装至100ml锥形瓶中，分装体积均为50ml，将分离得到的内生菌株挑取大小均匀的菌丝体于锥形瓶中，每个浓度三次重复，置于28℃的恒温水平摇床上于135rpm振荡培养6d后，观察不同浓度下菌落的长势；选择对cd
2+
具有较强抗性的菌株，保存于pda斜面上，并将该菌株命名为df101；（4）菌株df101的鉴定
①
df101形态学特征：培养初期菌落边缘整齐呈白色，长有茂密的灰色菌丝，呈棉絮状，近圆形，不透明，6d后菌落开始变成黄褐色（图1 a：正面、b：背面）；
②
分子鉴定：采用mobio powersoil
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dna试剂盒提取该菌株总dna，经检测后送测序公司进行序列测定，测序结果如seq id no:1所示，将测序结果与ncbi上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，其与s. phragmitis同源性达98.93%，最终将该菌株鉴定为s. phragmitis。
12.实施例 2：种子内生真菌s. phragmitis df101镉耐性实验将分离得到的内生菌株接种到pda平板上，配制含cd
2+
浓度0、50、100、200、400、600mg/l的pdb培养基，分装至100ml锥形瓶中，分装体积均为50ml，将长势良好的菌株挑取大小均匀的菌块于锥形瓶中，每个浓度三次重复，置于28℃的恒温水平摇床上于135rpm振荡培养6d后，观察菌块长势，用重量法测定菌丝体干重，其中cd
2+
浓度为0mg/l的培养液为对照组，按公式计算可得重金属对菌株的抑制效率；生长抑制率=（对照菌丝干质量-处理菌丝干质量）/对照菌丝干质量
×
100 %结果见表1，菌株s. phragmitis df101在较高镉浓度的pdb培养基内的可以生长，说明s. phragmitis df101具有较好的镉耐受能力；表1 菌株df101重金属耐受能力
注：上表中“+”具良好抗性；“+
‑”
有抗性，但生长状况不佳；
“‑”
无抗性。
13.实施例 3：种子内生真菌s. phragmitis df101解磷能力的测定溶磷能力：将s. phragmitis df101在pdb培养基中28℃、125rpm摇床培养4d后，将长势良好的菌株挑取大小均匀的菌块接入无机磷液体发酵培养基（含葡萄糖10g、硫酸氨0.5g、氯化钠0.3g、氯化钾0.3g、七水硫酸镁0.3g、七水硫酸亚铁0.03g、四水硫酸锰1g、磷酸三钙5g、蒸馏水1l，ph 7.0-7.5）上，同时以接入同等量的pdb液体培养基作为空白对照，每种处理设三个重复，28℃、125rpm在摇床上培养10d；采用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量（分光光度计波长700nm），具体步骤如下：
①
取发酵液10000rpm离心15min，取上清液1ml置于50ml容量瓶中，加入2，6-二硝基苯酚指示剂2滴，用10%氢氧化钠或者5%稀硫酸调节ph至溶液刚呈微黄色，加入钼锑抗显色剂5ml后加入去离子水定容至50ml；
②
静置30min后在分光光度计700nm下比色，同时测定空白对照组；
③
实验同时绘制磷标准曲线，分别吸取5mg/l磷标准溶液0、2、4、6、8、10ml于50ml容量瓶中，加入2，6-二硝基苯酚指示剂2滴，用10%氢氧化钠或者5%稀硫酸调节ph至溶液刚呈微黄色，加入钼锑抗显色剂5ml后加入去离子水定容至50ml，获得0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/l磷标准系列溶液，静置30min后在分光光度计700nm下比色，绘制标准工作曲线（图2），然后将步骤
②
测得的吸光度值代入标准工作曲线，获得s. phragmitis df101在无机磷培养液中的溶磷量为43.026 mg/l（图4），说明s. phragmitis df101具有将无机磷转化成有机磷的能力，使植物更易吸收磷，进而促进植物生长。
14.实施例4：种子内生真菌s. phragmitis df101产iaa能力的测定s. phragmitis df101在pdb培养基（含有l-色氨酸0.5mg/ml）中28℃、125rpm的摇床上黑暗培养10天，取1ml菌液12000rpm离心15min，去沉淀，取0.5ml上清液添加等量的salkowski's 反应液（1ml 0.5m氯化铁，49ml 35%高氯酸），在黑暗处反应30min，在530nm下测定吸光值，每组重复三次，以不接菌培养基同上处理作为对照调零；浓度0、2.5、5、10、20、40、60、80、100 mg/l的 iaa标准溶液采用上述方法测定吸光度值并绘制标准曲线（图3），然后将接种s. phragmitis的实验组的吸光度值代入标准曲线，获得s. phragmitis df101分泌iaa量为17.637 mg/l（图4），s. phragmitis df101以l-色氨酸为前体合成植物激素iaa，刺激植物细胞生长和增殖，有效吸收水分和养分，同时调节植物体的生命活动。
15.实施例5：种子内生真菌s. phragmitis df101产铁载体能力的测定将s. phragmitis df101在pdb培养基中28℃、125rpm摇床培养4d后，将长势良好的菌株挑取大小均匀的菌块接入无铁察氏培养基（含有蔗糖30g、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、蒸馏水1l）中，并在28℃、125rpm下振荡培养5d后，8000rpm离10min后收集培养上清液，将1ml上清液与1ml cas检测液混匀，混合物在黑暗中反应15min，在630nm下测定吸光值，该值记为as，在空白不接菌对照中用同样的方法测定od
630
值，记为ar，以去离子水作为对照调零，具体计算公式为铁载体活性=[(ar-as)/ar]
×
100%；计算结果为菌株df101的螯合铁载体能力为74.52%，铁载体是一类由低铁环境中细菌和真菌合成并分泌的具有很强特异性螯合fe
3+
的小分子化合物，研究表明一些产铁载体的菌能使铁元素在植物根际富集，从而改善了植物铁营养的吸收，达到促进植物生长的作用。
[0016]
实施例6：重金属胁迫下种子内生真菌s. phragmitis df101对土荆芥种子萌发的影响本实施例旨在证明s. phragmitis df101对种子萌发的促进作用；以土荆芥（dysphania ambrosioides l.）为供试植物，实验过程如下：a、s. phragmitis df101悬浮液的制备：挑选之前纯化后的df101菌株，接种到pda平板中活化，置于28℃隔水式恒温培养箱中培养7d后，挑选长势良好且无污染的平板，挑取菌丝体接种到pdb培养基中，于28℃、125rpm的恒温摇床中培养4d后，在无菌条件下，将菌丝体滤出，用无菌水冲洗3遍，避免菌丝体上沾有培养基，然后用无菌剪刀剪碎，将剪碎后的菌丝转移至无菌水中定容至150ml，制成df101菌丝悬浮液；b、选择大小均匀且饱满的土荆芥种子进行表面消毒: 体积分数75%的乙醇漂洗2次，每次时间为2min30s，无菌水冲洗5次。将表面消毒后的种子浸泡在df101菌丝悬浮液中为（e+），浸泡2h定殖，种子浸泡在等体积的无菌水中为对照组（ck）将浸泡后的种子置于浸润在含有不同浓度的cd
2+
溶液的培养皿中（培养皿铺有两层灭菌的滤纸，每个培养皿中cd
2+
溶液为5ml）；cd
2+
溶液浓度为 0、30、50、100、200mg/l，每个浓度设置三个重复组，每皿放置25粒种子，在自然光照下进行培养，从种子开始萌发记录种子的萌发数，直到无萌发为止，统计种子发芽粒数，计算萌发率(%)为(gt/t)
ꢀ×
100，其中gt为萌发种子数，t为种子数。
[0017]
结果如图5所示，结果显示s. phragmitis df101在重金属胁迫下对土荆芥种子有明显的促进萌发的作用、提高幼苗存活率、增强其镉抗性。
[0018]
上述实施例的结果说明本发明中分离得到的种子内生真菌s. phragmitis df101，具有溶磷、产iaa和铁载体的能力，以及较好的耐镉能力，且在重金属胁迫下对土荆芥种子萌发有较好的促进作用。