一种苦参酮的提取方法及在抗农作物病原真菌的应用与流程

1.本发明涉及苦参酮领域，尤其是涉及一种苦参酮的提取方法及在抗农作物病原真菌的应用。


背景技术：

2.中国自古以来便是农业大国，但农作物在种植的过程中总会受到植物病害的威胁，据统计，植物病害致使大田作物的产量每年约损失10-16%，其中这些病害约有70-80%都是由植物病原真菌引起的。植物真菌性病害一直是作物生产和产品储藏过程中的制约因素之一，对于产品的发育阶段、营养价值、有限保质期等问题方面都造成了严重损失。化学农药因其高效、效率快、廉价、使用方便，对作物产量和收入做出了巨大贡献。然而，长期依赖和大量使用化学农药造成的环境和农产品污染、生态失衡和食品安全问题也日益出现。随着公众对环境保护意识的提高和对绿色食品和无污染食品的要求的增加，农药的“回归自然”和“无污染”是社会发展和自然科学的必然趋势。开发安全、无毒、来源广泛、低成本的植物源农药，具有重要的经济、生态和社会意义。
3.植物源农药作为生物农药的一部分，因公认其具有低毒、无残留、选择性高、易分解、不易产生抗药性等优点，而成为农药研究与开发的热点之一。因此，从植物资源中寻找和筛选潜在的杀菌次生代谢产物，正在成为新型杀菌剂创制的主要途径之一。黄酮类是自然界中广泛分布的次生代谢物，具有抗炎、抗氧化、抗菌等药理作用。研究表明，一些黄酮类化合物还具有杀触、杀胃、拒食、抑制生长发育等杀虫活性。近年来，异戊烯基黄酮类化合物通常被认为是作为植物防卫素，在植物抵御外来生物的侵袭过程中发挥重要的生理调节作用。 随着对该类成分更深入的研究， 表明黄酮类化台物的异戊烯基化可增强其抗菌和防虫等活性。
4.中草药苦参为豆科植物苦参（sophora flavescenes ait）的干燥根，苦参作为传统中药材，有几千年的药用历史，临床应用广泛，有抗肿瘤、抗病毒、抗病原微生物、抗氧化、抗炎等作用。其化合物种类丰富，包括生物碱、黄酮、三萜皂苷、木质素及酚酸等，其主要的有效成分是生物碱类和黄酮类化合物。其中黄酮成分主要是以苦参酮为代表的异戊烯基二氢黄酮，这类成分具有抗菌、抗磷酯酶活性、抗肿瘤、 抗心律失常等多种生物活性，并且具有很明显的化学分类学特征。所述苦参酮具有如下分子结构：
。
5.但是，经发明人研究发现，现有的苦参酮提取方法操作复杂，不易于工业化生产；同时，现有的苦参酮提取方法的提取效果不理想，提取获得的苦参酮纯度较低，无法实现苦参酮的针对性提取。
6.进一步的，现有技术中，苦参提取物已被批准用做农药驱虫剂，其主要的活性成分是生物碱类物质。针对苦参黄酮类成分，虽然已有文献报道其对辣椒枯萎病和黄瓜枯萎病等具有抑制作用，但研究对象都是针对于苦参总黄酮的提取及应用，而并非针对结构明确的高纯度活性单体成分（苦参酮）。作为苦参黄酮类成分中含量较高的单体物质，现有技术虽然公开了苦参酮在制备抗水产病原菌药物或饲料添加剂中的应用，但对于苦参酮在抗农作物病原真菌方面的应用仍不明确，有待进一步拓展。


技术实现要素：

7.为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供种苦参酮的提取方法及在抗农作物病原真菌的应用，能够实对苦参酮的针对性提取，其操作方法简洁，提取效果好，提取获得的苦参酮纯度高，易于工业化生产；同时，进一步拓展苦参酮在抗农作物病原真菌方面的应用。
8.为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种苦参酮的提取方法，包括以下步骤：一次提取、二次提取、三次提取，重结晶；所述一次提取，将苦参干燥根粉碎后，采用一次提取溶剂加热回流提取后，减压回收一次提取溶剂，制得浓缩物；浓缩物经水洗、碱洗后，在ph4-7条件下，静置沉淀，过滤，水洗至中性，过滤滤饼经干燥制得一次提取物；所述二次提取，一次提取物经混合溶剂溶解后，采用同规格混合溶剂作为洗脱剂，经葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱进行分段处理后，采用薄层层析对含有苦参酮的组分进行跟踪筛选，合并筛选出的含有苦参酮的组分，减压回收混合溶剂，制得二次提取物；所述三次提取，二次提取物经甲醇水溶液溶解后，经c18反相硅胶柱层析进行精制后，采用薄层层析对苦参酮样品进行跟踪筛选，合并筛选出的含有苦参酮的所有洗脱液，加压回收溶剂，制得三次提取物；所述重结晶，三次提取物经重结晶，制得苦参酮。
9.优选的，所述一次提取中，一次提取溶剂为以下至少之一：乙醇、甲醇、乙酸乙酯、
丙酮。
10.进一步的，所述一次提取中，将浓缩物分散于5-10倍重量的去离子水中，采用酸水调节ph值至3-4，2000-4000rpm均质搅拌后，离心，去除上清液，重复水洗3-4次；所得沉淀物经3-5倍重量的碱水溶解洗涤3-5次后，4000-5000rpm离心，合并上清液，并采用稀盐酸调节ph值至4-7，静置沉淀，过滤，水洗至中性，过滤滤饼经干燥制得一次提取物。
11.优选的，所述酸水，为以下之一：盐酸水溶液、硫酸水溶液、磷酸水溶液。
12.优选的，所述碱水，为以下之一：氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸钾水溶液。
13.优选的，所述二次提取或三次提取中，薄层层析的固定相为硅胶gf254，展开剂为体积比为10:1的氯仿和甲醇。
14.优选的，所述二次提取中，混合溶剂为氯仿和甲醇混合溶剂，氯仿与甲醇的体积比为1-3:1。
15.优选的，所述三次提取中，甲醇水溶液中甲醇浓度为40-80%。
16.优选的，所述重结晶中，采用的溶剂为以下至少之一：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯。
17.苦参酮在抗农作物病原真菌的应用，苦参酮在抗农作物病原真菌药物中的应用。
18.进一步的，所述农作物病原真菌，为以下至少之一：稻瘟病菌、油菜菌核病菌、立枯丝核菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果为：（1）本发明的苦参酮的提取方法，通过特定的一次提取、二次提取、三次提取步骤，经重结晶制得苦参酮单体，能够实对苦参中苦参酮的针对性提取，提取效果好，苦参酮单体的hplc纯度可达97.8%。
20.（2）本发明的苦参酮在抗农作物病原真菌的应用，苦参酮杀菌活性高，对油菜菌核病、立枯丝核菌、番茄灰霉病、小麦赤霉病、稻瘟病、辣椒疫霉病的病原真菌具有优异的抑菌作用；在实现高效抑菌的同时，所述苦参酮单体还具有低毒、安全、易于提取的特点，能够有效用于油菜菌核病、立枯丝核菌、番茄灰霉病、小麦赤霉病、稻瘟病、辣椒疫霉病的防治中。
21.（3）发明的苦参酮在抗农作物病原真菌的应用，苦参酮在100μg/ml下对稻瘟病菌、油菜菌核病菌、立枯丝核菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌和番茄灰霉病菌的抑制率均能够超过50％，抑菌活性好；且抑菌活性高于嘧菌酯的抑菌活性。
22.（4）本发明的苦参酮的提取方法，制得的一次提取物中苦参总黄酮含量可达71.4%，提取效果好。
23.（5）本发明的苦参酮的提取方法，操作方法简洁，制得的苦参酮单体质量稳定，易于工业化生产。
具体实施方式
24.为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
25.实施例1一种苦参酮的提取方法，具体如下：1、一次提取
取苦参干燥根，粉碎成粗粉后，采用10倍体积的乙醇（浓度为95%）加热回流提取两次，每次提取3小时，合并提取液，减压回收乙醇至干，得到浓缩物；将浓缩物分散于5倍重量的去离子水中，采用浓度为10%的盐酸水溶液调节ph值3；2000rpm转速条件下，均质机充分搅拌后，离心，去除上清液，重复水洗3次以除去浓缩物中的生物碱；所得的沉淀物经5倍重量份的氢氧化钠水溶液（浓度为0.5%）溶解洗涤3次，4000rpm离心5min，合并上清液；采用浓度为5%的盐酸水溶液调节ph至6，静置沉淀0.5h，过滤，水洗至中性，滤饼经冷冻干燥，制得一次提取物，即苦参总黄酮提取物。
26.2、二次提取采用混合溶剂溶解一次提取物；采用同规格混合溶剂作为洗脱剂，经葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱进行分段处理，获得ks-1至ks-8共八个组分，通过薄层层析（固定相为硅胶gf254，展开剂为氯仿:甲醇=10:1）对含有苦参酮的组分进行跟踪筛选；合并筛选出的含有苦参酮的组分（ks-6和ks-7两个组分），减压回收溶剂，制得二次提取物，即苦参酮粗产物。
27.其中，混合溶剂为氯仿/甲醇混合溶剂，氯仿与甲醇的体积比为1:1。
28.3、三次提取采用甲醇水溶液（浓度为60%）溶解二次提取物，经c18反相硅胶柱层析进行精制，获得kc-1至kc-10共十个组分，通过薄层层析（固定相为硅胶gf254，展开剂为氯仿:甲醇=10:1）对苦参酮样品进行跟踪筛选，合并筛选出的含有苦参酮的所有洗脱液（kc-3、kc-4、kc-5三个组分），减压回收溶剂，制得三次提取物，即苦参酮精制物。经检测，三次提取物中苦参酮含量＞85%。
29.4、重结晶三次提取物经重结晶（所用溶剂为甲醇），制得苦参酮单体。
30.实施例2一种苦参酮的提取方法，具体如下：1、一次提取取苦参干燥根，粉碎成粗粉后，采用15倍体积的丙酮（浓度为95%）加热回流提取两次，每次提取2小时，合并提取液，减压回收乙醇至干，得到浓缩物；将浓缩物分散于10倍重量的去离子水中，采用浓度为10%的磷酸水溶液调节ph值4；4000rpm转速条件下，均质机充分搅拌后，离心，去除上清液，重复水洗4次以除去浓缩物中的生物碱；所得的沉淀物经3倍重量份的氢氧化钾水溶液（浓度为0.5-0.7%）溶解洗涤5次，5000rpm离心10min，合并上清液；采用浓度为5%的盐酸水溶液调节ph至7，静置沉淀1h，过滤，水洗至中性，滤饼经冷冻干燥，制得一次提取物，即苦参总黄酮提取物。
31.2、二次提取采用混合溶剂溶解一次提取物；采用同规格混合溶剂作为洗脱剂，经葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱进行分段处理，获得ks-1至ks-8共八个组分，通过薄层层析（固定相为硅胶gf254，展开剂为氯仿:甲醇=10:1）对含有苦参酮的组分进行跟踪筛选；合并筛选出的含有苦参酮的组分（ks-3和ks-5两个组分），减压回收溶剂，制得二次提取物，即苦参酮粗产物。
32.其中，混合溶剂为氯仿/甲醇混合溶剂，氯仿与甲醇的体积比为3:1。
33.3、三次提取采用甲醇水溶液（浓度为80%）溶解二次提取物，经c18反相硅胶柱层析进行精制，获得kc-1至kc-10共十个组分，通过薄层层析（固定相为硅胶gf254，展开剂为氯仿:甲醇=10:1）对苦参酮样品进行跟踪筛选，合并筛选出的含有苦参酮的所有洗脱液（kc-2、kc-6、kc-10三个组分），减压回收溶剂，制得三次提取物，即苦参酮精制物。经检测，三次提取物中苦参酮含量＞85%。
34.4、重结晶三次提取物经重结晶（所用溶剂为丙酮），制得苦参酮单体。
35.实施例3一种苦参酮的提取方法，具体如下：1、一次提取取苦参干燥根，粉碎成粗粉后，采用8倍体积的甲醇（浓度为95%）加热回流提取两次，每次提取3小时，合并提取液，减压回收乙醇至干，得到浓缩物；将浓缩物分散于8倍重量的去离子水中，采用浓度为10%的硫酸水溶液调节ph值3；3000rpm转速条件下，均质机充分搅拌后，离心，去除上清液，重复水洗4次以除去浓缩物中的生物碱；所得的沉淀物经4倍重量份的碳酸钠水溶液（浓度为0.5-0.7%）溶解洗涤5次，4500rpm离心8min，合并上清液；采用浓度为5%的盐酸水溶液调节ph至5，静置沉淀1h，过滤，水洗至中性，滤饼经冷冻干燥，制得一次提取物，即苦参总黄酮提取物。
36.2、二次提取采用混合溶剂溶解一次提取物；采用同规格混合溶剂作为洗脱剂，经葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱进行分段处理，获得ks-1至ks-8共八个组分，通过薄层层析（固定相为硅胶gf254，展开剂为氯仿:甲醇=10:1）对含有苦参酮的组分进行跟踪筛选；合并筛选出的含有苦参酮的组分（ks-1和ks-6两个组分），减压回收溶剂，制得二次提取物，即苦参酮粗产物。
37.其中，混合溶剂为氯仿/甲醇混合溶剂，氯仿与甲醇的体积比为2:1。
38.3、三次提取采用甲醇水溶液（浓度为50%）溶解二次提取物，经c18反相硅胶柱层析进行精制，获得kc-1至kc-10共十个组分，通过薄层层析（固定相为硅胶gf254，展开剂为氯仿:甲醇=10:1）对苦参酮样品进行跟踪筛选，合并筛选出的含有苦参酮的所有洗脱液（kc-2、kc-4、kc-5、kc-9四个组分），减压回收溶剂，制得三次提取物，即苦参酮精制物。经检测，三次提取物中苦参酮含量＞85%。
39.4、重结晶三次提取物经重结晶（所用溶剂为乙醇），制得苦参酮单体。
40.试验例1采用紫外分光光度法，分别对实施例1-3中一次提取步骤制得的一次提取物中总黄酮含量进行测定，具体操作如下：1、精密称取苦参酮对照品适量，加甲醇制成每 1 ml 含260. 0μg苦参酮的溶液，即得对照品溶液。
41.2、分别精密称取实施例1-3中一次提取步骤制得的一次提取物40 mg，分别置于具
塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，密塞，称定质量，超声（250 w、50 khz）30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；取续滤液5 ml，定容至25 ml量瓶中，即得实施例1-3的供试品溶液。
42.3、测定对照品溶液及实施例1-3的供试品溶液在287nm下的吸光度，平行3 份，测定结果如下：试验例2采用液相色谱hplc法，分别对实施例1-3制得的苦参酮单体纯度进行检测，具体操作如下：色谱条件 dikma c 18 色谱柱（250 mm
×
4. 6 mm，5μm）；流动相甲醇-水（7:3），等度洗脱；体积流量1. 0 ml/min；检测波长290nm；柱温30℃；进样量20μl。测定结果如下：试验例3采用实施例1制得的苦参酮单体，测定苦参酮单体对植物源病菌的抑菌活性，具体如下：1、供试药剂：苦参酮单体（实施例1制得）2、供试菌种：稻瘟病菌、油菜菌核病菌、立枯丝核菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌和番茄灰霉病菌，各菌种均由甘肃省农业科学院提供。
43.3、抑菌活性测定方法：pda培养基的配制方法：（1）称重和熬煮按培养基配方逐一称取去皮土豆，土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用两层纱布趁热在量杯中过滤，弃掉滤渣，滤液用水稀释到1000ml。
44.（2）加热、溶解把稀释后的滤液放入锅中，加葡萄糖20g，琼脂15g，然后放在电磁炉上小火加热，并用玻璃棒不断搅拌，以防止治琼脂成团。待完全溶解后再补水至所需量。
45.（3）分装将配制好的培养基分装于100ml规格的锥形瓶中（固体培养基以不超过其溶剂的一半为宜）。
46.（4）加棉塞培养基分装完毕后，在锥形瓶口处封上封口膜，以阻止外界微生物进入培养基造成污染，并保证良好的通气性。
47.（5）灭菌将培养基置于压力蒸汽灭菌器上，控制压力为0 .15mpa，以121℃灭菌3h。
48.（6）制备培养基（含药无菌操作台）将培养基以20ml量分装于培养皿中，静置，冷却，待其凝固。
49.（7）上样（接种）对无菌操作台进行灭菌操作，点燃酒精灯，采用插空法，通过点样针将所需菌种在酒精灯外焰接种于培养皿中，用胶带封口。其中，打空器、点样针等仪器均放入乙醇中灭菌。
50.（8）培养将接种后的培养皿放入培养箱中进行培养。分别测定实施例1制得的苦参酮单体在各浓度条件下，对前述6种农作物病原真菌的抑制活性，每个浓度做3个重复实验，观察记录现象，计算抑菌率。同时，设置浓度为50μg/ml嘧菌酯作为对照样，对前述6种农作物病原真菌的抑制活性，每个浓度做3个重复实验，观察记录现象，计算抑菌率。具体结果如下：由上述试验结果可以看出，本发明实施例制备的苦参酮单体在100μg/ml下对稻瘟病菌、油菜菌核病菌、立枯丝核菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌和番茄灰霉病菌的抑制率均能够超过50％，抑菌活性好；且经对照试验可知，本发明实施例制备的苦参酮单体的抑菌活性高于嘧菌酯的抑菌活性。
51.除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
52.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。