用于扩增舒茶早SSR标记的引物组合及其在茶树自交育种中的应用

本发明涉及植物遗传育种和分子生物学领域，具体地说，涉及用于扩增舒茶早ssr标记的引物组合及其在茶树自交育种中的应用。

背景技术：

1、茶树(camellia sinensis(l.)o.kuntze)是一种雌雄同体且高度杂合的多年生木本植物，由于其具有自交不亲和性(self-incompatibility，si)的现象，阻碍了茶树自交系的发展，并且导致了茶树高度杂合的基因组。在许多植物中存在着促进异交的现象，这是植物在长期进化过程中防止近亲繁殖，保持遗传多样性的重要机制。前阶段研究发现，自交亲和性与茶树品种以及雌蕊发育阶段相关，并且差异较大，创制自交系可以有目性的增加后代的纯合性，并有助于促进茶树遗传与育种研究。

2、茶树传统自交育种方法均采取人工授粉法，其过程需要准备花粉、人工授粉、套袋以及后期摘袋等工序，茶树的花朵在授粉过程中会形成多重损伤，例如授粉花朵脱落、雌蕊损伤等，影响结实率。此外，由于茶树自交不亲和性，导致结实率较低，人工授粉需要消耗大量的人力物力，从而导致育种成本增加。

3、现有的茶树种质鉴定技术主要包括形态学鉴定和分子标记鉴定。形态学标记主要为树体特性，如树型、叶型、芽叶色泽等，但是形态标记在子代鉴定上有较大的不确定性，易受人为观测及环境等因素影响。现代分子标记技术的建立与成熟，为自交子代真实性的鉴定提供了更加准确而高效的方法，但是大多分子实验会涉及一些毒性试剂并且操作过程繁琐，鉴定工作并不安全高效。因此，如何安全高效的进行自交后代的鉴定，获得更多的自交种质，进而创制茶树自交系，成为目前的主要目标。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一套用于扩增舒茶早ssr标记的引物组合。

2、本发明另一的目的是提供所述引物组合在茶树自交育种中的应用。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套用于扩增舒茶早ssr标记的引物组合，包括7个ssr标记，分别为cs-ssr1～cs-ssr7；用于扩增它们的引物分别如seq id no：1-2、seq id no：3-4、seq id no：5-6、seq id no：7-8、seq id no：9-10、seq id no：11-12和seq id no：13-14所示。

4、第二方面，本发明提供所述ssr引物组合的以下任一应用：

5、1)用于舒茶早茶树品种的鉴定及选育；

6、2)用于舒茶早茶树品种的分子标记辅助育种；

7、3)用于构建舒茶早ssr指纹图谱；

8、4)用于制备舒茶早检测试剂；

9、5)用于茶树自交育种。

10、第三方面，本发明提供茶树自交育种的方法，所述方法包括：茶树开花前期，在茶园中搭建防虫网大棚，确保大棚内仅有舒茶早一个茶树品种；茶树开花时期，在大棚内放置授粉性蜜蜂，利用蜜蜂进行自花授粉，并利用所述ssr引物组合进行自交后代的鉴定。

11、具体方法包括以下步骤：

12、(1)田间管理：春茶过后，不再对目标茶树亲本进行修剪，茶园适当增施磷钾肥；在茶树开花前期，对茶树下部老叶烂叶进行清理，并适时修剪；

13、(2)搭建防虫网大棚：茶树开花前期，在茶园目标茶树品种四周搭建防虫网大棚，大棚内仅保留一个茶树品种；

14、(3)蜂传授粉：在大棚内，目标亲本茶树开花时期放置特定品种的蜂巢，利用蜜蜂进行自花授粉，并且每隔3天观察大棚的密封性以及蜜蜂状态并及时调整；

15、(4)自交后代的鉴定：利用所述ssr引物组合对子代进行pcr检测并结合毛细管电泳鉴定自交种。

16、进一步地，茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的行距为1.2-1.5米。株距与行距参数依照目标亲本茶树的树形适当调整，若目标亲本茶树为灌木型则株距与行距适当减小，反之增大。

17、优选地，防虫网大棚长10-13米，宽4-6米，高2.2-3米，孔目为60-80目，防虫网材质为尼龙纱帐。防虫网大棚的长宽高根据目标亲本茶树的树形、株距及行距以适当调整，若目标亲本茶树为灌木型则防虫网大棚长宽高适当减小有利于经济效益，若目标亲本茶树为乔木型防虫网大棚长宽高应适当增加，防止空间狭窄不利于蜜蜂飞行从而导致授粉效率下降。

18、进一步地，步骤(3)中蜂巢放置时间为当年10月中旬(地理位置31°25′n-31°29′n，117°09′e-117°13′e)，蜂巢中放置特定蜂种蜜蜂6000-8000头。蜜蜂数量可根据目标茶树开花数量合理调整，防止蜜蜂过多或过少对授粉不利。

19、优选地，大棚内配置的蜂种为中华蜜蜂。杂木树为主的森林群落及传统农业的主要传粉蜜蜂为我国独有的当家蜂种中华蜜蜂，其特殊优点在于采集力强、利用率较高、采蜜期长及适应性、抗螨抗病能力强，消耗饲料少等，非常适合中国山区定点饲养，符合我国茶树的种植现状。若替换为其它蜂种(如意大利蜂)，可能不太适应传粉，导致授粉效率下降。

20、进一步地，步骤(4)包括：待茶果发褐成熟时，采摘成熟茶果晾晒并除皮，后期将茶籽播种于育苗圃，待茶籽成苗时移栽至资源圃，并利用所述ssr引物组合对子代进行pcr检测并结合毛细管电泳鉴定自交种。

21、进一步地，步骤(4)包括如下子步骤：

22、1)取亲本与子代的茶树叶片并利用改良的ctab法分别提取基因组dna；

23、2)以1)提取的dna为模板，利用7对引物进行pcr扩增；

24、3)利用毛细管电泳对扩增产物进行检测，根据电泳条带判定子代是否为自交种：用于扩增标记cs-ssr1的引物对应的扩增产物出现246bp和258bp的特征条带，用于扩增标记cs-ssr2的引物对应的扩增产物出现256bp的特征条带，用于扩增标记cs-ssr3的引物对应的扩增产物出现279bp和285bp的特征条带，用于扩增标记cs-ssr4的引物对应的扩增产物出现267bp的特征条带，用于扩增标记cs-ssr5的引物对应的扩增产物出现185bp和193bp的特征条带，用于扩增标记cs-ssr6的引物对应的扩增产物出现184bp的特征条带，用于扩增标记cs-ssr7的引物对应的扩增产物出现274bp和279bp的特征条带，判定为真实自交种；

25、优选地，pcr反应体系为10μl：45μg/mldna模板1μl，10μm上、下游引物各0.5μl，2×taq plus master mix 5μl，ddh2o 3μl。

26、优选地，pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

27、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

28、(一)本发明利用防虫网将单个茶树品种进行隔离，防止其他茶树品种的异花授粉，保证其自花授粉。

29、(二)本发明利用在防虫网大棚内进行中华蜜蜂传粉的方法，极大改善了人工自花授粉对茶树花朵的伤害性大，并且免去了挂牌、套袋、人工授粉、摘袋等复杂工序，降低工作成本，同时提高授粉效率。

30、(三)本发明采用的ssr分子标记鉴定方法，具有稳定性好、准确率高的特点。进一步通过结合使用fragment analyzertm全自动毛细管电泳系统，该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对于子代鉴定的结果更加精确、快速、简单、高效。

31、(四)茶树蜂传授粉所得的子代再利用高质量的分子标记进行鉴定，剔除可疑的子代，这样能够确保所收获的自交种准确率达到100％。