一种新型抗菌肽及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种新型抗菌肽及其应用。

背景技术：

1、牙髓病及根尖周病是常见的口腔感染性疾病，主要是由于根管系统内细菌等微生物感染所致。针对牙髓病和根尖周病目前最有效、最常用的治疗方法是根管治疗，根管治疗在通过机械清理和根管消毒的方式清除根管内的感染物后，再经过严密的根管充填，使得根管系统与口腔环境和根尖周围环境隔离，以达到控制感染，促进根尖周病变的愈合以及防止根尖周病变的发生，最后达到保存患牙的目的。但根管系统内残留微生物感染仍可导致根管治疗失败。研究显示不伴根尖周病变的患牙根管治疗成功率为92％，然而伴有根尖周病的患牙成功率降至74％。在大部分病例中根管治疗失败的主要原因之一是完成根管治疗后根管内仍有细菌的存在。

2、粪肠球菌(enterococcus faecalis，e.faecalis)为革兰氏阳性兼性厌氧菌，常见于人类口腔、胃肠道和阴道。e.faecalis是根管治疗失败后患牙中最常检测到的菌种，多项研究表明其检出率均高达90％。根管内残留的e.faecalis会造成根尖周组织的持续性感染，且与疼痛等临床症状密切相关。在这种持续性感染的状态中，根管内e.faecalis的检出率是原发性感染根管的9倍，可见e.faecalis在根管感染中具有重要作用。

3、抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)是具有抗菌、抗病毒作用的一类小分子多肽类物质。amps因广泛存在于多细胞真核生物的上皮屏障和免疫防御系统中，有时也被称为宿主防御肽(host-defense peptides，hdps)。其具有多种生物活性，如免疫调节、抑制癌细胞等、促进伤口愈合等，而且对传统抗生素耐药菌亦有较好的抑制作用。amps作为可能代替抗生素的新一代抗菌药物而受到广泛关注和研究。amps的抗菌机制主要包括膜靶向和非膜靶向两种方式。amps在细菌表面吸附聚集后，可以跨膜穿透细胞膜，破坏细菌细胞膜的完整性，直接杀灭细菌。amps也可与细胞壁前体脂质ii结合，影响细菌细胞壁的完整性，快速杀死细菌。另外，amps还可以直接跨膜在细胞内聚集，与负电荷大分子结合，抑制细菌的关键生理过程，如抑制蛋白质、核酸的合成或者直接抑制酶的活性等，从而通过非膜靶向的方式杀菌。

4、目前已发现或合成多种对e.faecalis具有抗菌作用的amps。ll-37在体外表现出抗浮游态e.faecalis作用；nisin与氢氧化钙联合作为根管内封药时可明显减少体外根管模型内的e.faecalis；hbd3凝胶可在体外抑制牙本质模型上e.faecalis的增殖；djk-5与naclo及edta联合使用时可有效去除体外根管模型内e.faecalis感染及玷污层；体外研究表明，gh12可通过下调e.faecalis的多种毒力因子的基因表达来抑制其活性。以上抗菌肽虽表现出对e.faecalis的抗菌作用，但多以联合用药的形式进行作用。epinecidin-1是源自于橙色石斑鱼的天然抗菌肽，属于piscidin家族。epinecidin-1原肽长为67个氨基酸，由三个域组成：前22个氨基酸构成疏水信号肽，中间25个氨基酸构成阳离子成熟肽，其余20个氨基酸构成阴离子c端前域。为研究epinecidin-1的药理活性，学者们成功合成并纯化了epinecidin-1氨基酸序列中第22～42位(共21个氨基酸)，将其命名为epi-1。epi-1在体内外均具有较好的抗菌活性，且对厌氧菌具有一定的抑制作用。epi-1对多重耐药菌株也具有良好的抗菌效果。与阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素等药物联合使用时，epi-1对多重耐药的幽门螺杆菌具有协同抑制作用。epi-1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效果优于于万古霉素。动物研究发现，epi-1可以保护铜绿假单胞杆菌感染的败血症小鼠，降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的败血症猪的死亡率。在免疫调节方面，epi-1具有炎症抑制作用。epi-1可降低myd88表达，抑制toll样受体的激活，从而抑制炎症反应；epi-1可减轻大肠杆菌脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应；epi-可抑制由脂磷壁酸诱导的巨噬细胞akt/p38信号通路的激活。在皮肤热损伤猪的动物模型中，epi-1可通过促进伤口区域的血管化、上皮细胞增殖、胶原蛋白合成以利于伤口愈合。由此可见epi-1具有多种生物活性，推测epi-1可能对e.faecalis具有良好的抗菌活性，有利于根管感染的控制。

5、无论是天然抗菌肽及其衍生肽，它们都具有较长的肽链，这不但造成了合成消耗大、临床转化难的问题，而且由于空间位阻等因素的存在，本身的抗菌效果未必能得到充分的体现；多数抗菌肽对生物膜的抑制作用较差，对感染的控制有限。

6、综上，本课题拟选择epi-1作为母肽模板，并尝试对其进行优化，旨在获得序列更短、抗菌活性更高、生物相容性更好的新型抗菌多肽，并通过体外研究及感染根管模型探究epi-1及其衍生肽对e.faecalis的抗菌作用，为其作为新型根管冲洗液提供理论和应用基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种序列更短、抗菌活性更高、生物相容性更好的新型抗菌多肽。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面，提供一种多肽，所示多肽的氨基酸序列如seq id no:1～2任一项所示。

4、本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所示核酸分子编码本发明第一方面所述的多肽。

5、在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子可为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：

6、1)编码所述多肽的dna分子；

7、2)编码所述多肽的cdna分子

8、3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述多肽的cdna分子或基因组dna分子；

9、4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述多肽的cdna分子或基因组dna分子。

10、本发明的第三方面，提供一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。

11、在本发明的一些实施方式中，所述载体包括质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

12、本发明的第四方面，提供一种细胞，所示细胞包含本发明第三方面所述的载体。

13、在本发明的一些实施方式中，所述细胞包括酵母、细菌、藻或真菌。

14、本发明第五方面，提供本发明第一方面所述多肽或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述细胞在以下至少一项中的应用：

15、a)制备抑菌或杀菌或抗菌的产品；

16、b)抑菌或杀菌或抗菌；

17、c)抑制或清除细菌生物膜形成；

18、d)制备抑制或清除细菌生物膜形成的产品；

19、e)制备预防和/或治疗细菌感染引起的疾病的产品；

20、f)制备添加剂；

21、g)制备口腔用品。

22、在本发明的一些实施方式中，所述细菌包括粪肠球菌、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌中的至少一种。

23、在本发明的一些实施方式中，所述疾病包括口腔感染性疾病。

24、在本发明的一些实施方式中，所述疾病包括龋齿、根尖周病、牙髓病。

25、在本发明的一些实施方式中，所述添加剂为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品添加剂或卫生产品添加剂。

26、本发明的第六方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述多肽或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述细胞。

27、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药物、试剂、口腔用品、添加剂。

28、在本发明的一些实施方式中，所述口腔用品包括牙膏、漱口水、牙贴、口腔敷料、口腔喷剂。

29、本发明的有益效果是：

30、本发明通过对epi-1的结构进行优化，截去两端非α区域，通过个别氨基酸替换得到为16个氨基酸序列的目标抗菌肽，获得了序列更短、抗菌活性更高、生物相容性更好的新型抗菌多肽f-3，还提供编码抗菌肽的核酸分子以及包含上述核酸分子的表达载体或重组细胞。经体外验证发现相对于母肽，衍生肽f-3具有更高的抗菌活性或较高的杀菌速率，f-3最小抑菌浓度小于母肽epi-1；f-3还可以高效抑制或清楚粪肠球菌生物膜的形成，且毒性低，生物相容性好，可以用于制备防控粪肠球菌感染引起的疾病的药物；而且序列更短降低了合成成本，具有很好的应用前景。