一种Diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及一种diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、diego血型系统的基因是slc4a1(genbank id：ng_007498.1)，该基因编码的蛋白质是阴离子交换剂家族的一部分。slc4a1在红细胞质膜中表达，可作为氯化物/碳酸氢盐交换剂，参与二氧化碳从组织到肺的转运。人类已知该基因有许多突变，这些突变可分为两类。一类可导致疾病，主要是红细胞膜不稳定导致遗传性球形红细胞增多和/或肾脏细胞分泌缺陷导致远端肾小管酸中毒。第二类主要是其他不会引起疾病的突变会产生新的血型抗原，形成diego血型系统。从突变形式上看，杂合缺失和无义突变也有重要的临床意义。东南亚卵母细胞增多症(sao，美拉尼西亚卵母细胞增多症)是由于编码蛋白中存在杂合缺失所致，在恶性疟原虫疟疾流行的地区很常见。该基因也有无义突变，可导致非常严重的贫血和肾钙质沉着症。

2、diego血型系统目前发现有23个抗原，具有重要的临床意义。血型不合会引发溶血性输血反应和新生儿溶血病，甚至危及患者生命。常规的方法基于血型血清学技术，需要相对应的抗体试剂，稀少且价格昂贵。考虑到每个抗原对应特定的等位基因，可通过对突变位点进行检测来确定。

3、现有的基因检测技术通过桑格法或者高通量测序，获得diego血型基因的目标序列，然后与标准序列进行比对。桑格法测序需要选定并针对目标序列设计测序引物，测序的结果片段因人而异，所测序列的质量和准确度也因待测对象和引物的不同而不同。高通量测序能够获得较长的目标序列，然而需要多次重复检测进行拼接，较为耗时费力，而且成本高，只有某些样本有特殊需求才用。还有用凝胶电泳基因分型的方法，操作相对简单，缺点也很明显，譬如较为费时；不便于实现自动化；精确度不高；位点设计单一。

4、可见，以前的试剂和方法难以满足临床日益增长的检测需求。

技术实现思路

1、因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种diego血型基因分型的引物组、试剂盒及其检测方法(荧光pcr法)，以满足快速、精确检测不同diego血型的需要。

2、为此，本发明提供了如下的技术方案：

3、一种diego血型基因分型的引物组，包括能够扩增slc4a1基因中靶标位点为c.1694的引物对。

4、所述靶标位点为c.1694的引物对为靶标位点为c.1694g的引物对或/和靶标位点为c.1694g>c的引物对。

5、所述扩增靶标位点为c.1694g的引物对，其上游引物序列如seq idno.1所示，其下游引物序列如seq id no.2所示；

6、所述扩增靶标位点为c.1694g>c的引物对，其上游引物序列如seq idno.3所示，其下游引物序列如seq id no.4所示。

7、本发明的引物组还包括扩增slc4a1基因中靶标位点为c.1972的引物对，优选为扩增靶标位点为c.1972g的引物对或/和靶标位点为c.1972g>a的引物对。

8、所述扩增靶标位点为c.1972g的引物对中，其上游引物序列如seq idno.5所示，其下游引物序列如seq id no.6所示；

9、所述扩增靶标位点为c.1972g>a的引物对中，其上游引物序列如seq id no.7所示，其下游引物序列如seq id no.8所示。

10、本发明的引物组还包括扩增slc4a1基因中靶标位点为c.2561c或/和c.2561c>t的引物对；

11、优选的，所述扩增靶标位点为c.1972g>a的引物对中，其上游引物序列如seq idno.7所示，其下游引物序列如seq id no.8所示；

12、所述扩增靶标位点为c.2561c的引物对中，其上游引物序列如seq idno.9所示，其下游引物序列如seq id no.10所示；

13、所述扩增靶标位点为c.2561c>t的引物对中，其上游引物序列如seq id no.11所示，其下游引物序列如seq id no.12所示。

14、一种试剂盒，包括上述的一种diego血型基因分型的引物组。

15、本发明中的一种试剂盒，还包括孔板，针对不同靶标位点扩增的引物对分别设置在孔板的不同孔中；

16、优选的，针对相同靶标位点的不同变异设置不同的引物对，相同靶标位点的不同引物对设置在相邻的两个孔中；

17、更为优选的，所述孔板至少包括一组孔槽，每组孔槽包括6个孔，每组孔槽的每个孔分别包括靶标位点为c.1694g、c.1694g>c、c.1972g、c.1972g>a、c.2561c和c.2561c>t的引物对；

18、和/或，每个孔中均无额外设置内参引物。

19、一种基于非治疗目的检测diego血型的方法，包括提取待测血液中的dna作为模板，以上述的引物组作为扩增引物，进行实时荧光pcr扩增，获得荧光信号与温度变化的熔解曲线，判断分型结果。

20、所述实时荧光pcr扩增的pcr扩增程序为：

21、

22、熔解曲线的采集条件采用现有公开条件均可；优选的，熔解曲线的采集条件为:每秒升温0.4℃，每0.5℃采集1次荧光值，采集温度范围60-98℃。

23、本发明技术方案，具有如下优点：

24、1.本发明提供了基于diego血型抗原基因位点设计专一性引物，包括能够扩增slc4a1基因中靶标位点为c.1694的引物，利用该引物结合荧光染料进行实时荧光pcr扩增及熔解曲线反应，当引物序列与待测序列互补时，通过pcr反应将目的片段复制与放大，再通过熔解曲线的荧光信号与温度变化，检测特异性产物在双链解离50％时的温度(tm)，通过温度(tm)即可判断是否存在特异性扩增，有特异性扩增产物即代表该靶标位点为阳性，无特异性扩增即为阴性，进而有效实现血型的简单、准确判断。

25、2.本发明优选提供6组引物对，分别针对不同靶标位点进行准确扩增，六对引物均能有效避开目前为止发现的突变位点，具有检测准确度好的优势，并且，结合所设计的反应体系能提高pcr扩增的效率和准确度。

26、3.本发明提供的试剂盒中，其中孔板至少包括一组孔槽，且每组孔槽包括6个孔，每组孔槽的每个孔分别包括靶标位点为c.1694g、c.1694g>c、c.1972g、c.1972g>a、c.2561c和c.2561c>t的引物对；每组孔槽可以适应一人份检测，当孔板中孔槽有多组时，即可适用于多人份检测。

27、4.本发明提供的试剂盒中，针对同一靶标位点的两种不同碱基变异设计了对应引物，可以识别纯合和杂合以及无效检测。具体判读方法为：同一位点，两个检测结果均为阳性时判定为杂合子；同一位点，一个检测结果为阳性，一个检测结果为阴性，则为纯合子，纯合碱基与该显示阳性的孔位的变异对应；如果同一位点，两个检测结果均为阴性，则判定为实验结果无效。

28、5.本发明针对diego血型基因分型的试剂盒中，每个孔无需额外添加内参引物，可以简化实验，节约成本。