一种提高磷脂酶D合成PS活性的单点突变方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种提高磷脂酶d合成ps活性的单点突变方法。

背景技术：

1、磷脂(phospholipids)是含有磷酸基化合物的统称，分子结构由2条疏水长碳链和1个极性头部组成。磷脂最早被发现于蛋黄中，是生命体细胞膜的主要组成成分，广泛分布于动植物的各种细胞组织内，承担着信号传导和促进新陈代谢的重任。磷脂的主要生理活性功能是由它的极性头部决定的，根据极性头部的种类，磷脂可以被分为：磷脂酰胆碱(phatidylcholine，pc)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylerhanolamine，pe)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，pi)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，pg)等。虽然磷脂在自然界分布广泛，种类繁多，但是这些磷脂在自然界中分布却十分不均匀。其中，ps是存在于细胞膜上必不可少的活性物质，可以调控膜蛋白可以被人体快速吸收，高效穿越脑血屏障，安全地减缓甚至修复人脑中神经细胞的受损细胞膜。从而达到改善患者认知能力，学习能力和记忆能力的功效，对阿尔兹海默症的治疗具有一定的辅助作用。主要从大豆中提取获得，也存在于大脑细胞和花生中。在动物中，ps主要存在于大脑和肝脏的细胞中，由于动物容易染病使产品的安全性受到了威胁；在植物中，磷脂含量较多的是pc，相对而言，ps的含量很少，提取困难。所以，利用酶转化法合成ps应运而生，具有操作稳定、高度专一性等优势。

2、磷脂酶d(pld)是特殊的磷脂水解酶，能够催化磷脂水解，释放原来磷脂的极性头部，生成磷脂酸(pa)。此外，在含有第二底物(亲核试剂，如丝氨酸，乙醇胺，甘油等)条件下，磷脂酶d能够催化裂解磷脂磷酸二酯键发生断裂，并促进磷酰基与亲核试剂结合，生成新的磷脂。pld催化的磷脂酰基转移反应是目前使用最为广泛，也是最有效的ps人工合成方法。

3、但是，目前已知的pld磷脂酰基转移活力，反应选择性和稳定性都有待提高。分子对接(molecular docking)技术研究底物与酶结合的可能性，配合分子动力学(moleculardynamics)模拟确定结合复合物稳定性，进一步通过底物与酶结合自由能计算(bindingfree energies analysis)判断反应进行的方向和程度。利用蛋白质理性设计，可以最大程度降低定点突变的实验工作量，考虑每个突变位点都有20种突变情况(19种替换突变和1种删除突变)，利用生物分子模拟技术可以虚拟筛选突变体文库，大大提高实际突变效率。目前关于虚拟突变pld催化性能的研究几乎没有报道，且pld催化性能有待提高。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种提高磷脂酶d合成ps活性的单点突变方法，以提高pld催化性能。

2、为达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种磷脂酶d的突变蛋白，对磷脂酶d的氨基酸序列进行点突变，所述磷脂酶的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列；所述突变的点位为：d175a、d175l、s451a、s451l、t194a、t194l、s457a或s457l。

4、本发明还提供了一种表达上述突变蛋白的重组菌。

5、优选的，作为一种改进，所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。

6、本发明还提供了上述重组菌的构建方法，包括以下步骤：

7、(1)培养野生型e.coli top10/pbadkp-pld2，其中载体为质粒pbadkp，宿主细胞为e.coli top10，具体构建方法见专利cn109136207b；

8、(2)利用plasmid mini kitⅰ试剂盒从菌株e.coli top10/pbadkp-pld2中提取含有seq id no.1所示氨基酸序列编码基因的质粒pbadkp，将质粒pbadkp作为突变pcr的模板；

9、(3)利用定点突变引物对质粒进行pcr扩增，得到扩增产物；

10、(4)利用dpnⅰ酶消化扩增产物未突变的模板dna，得到消化产物；

11、(5)将消化产物用热激发导入e.coli top10感受态细胞，通过含有卡那霉素抗性的lb固体培养基进行单克隆的筛选，得到所述重组菌。

12、优选的，作为一种改进，步骤(3)所述的定点突变引物包括：针对d175a点突的突变引物d175a-f和d175a-r，所述d175a-f的核苷酸序列如包括seq id no.2所示，所述d175a-r的核苷酸序列如seq id no.3所示；

13、针对d175l点突的突变引物d175l-f和d175l-r，所述d175l-f的核苷酸序列如包括seq id no.4所示，所述d175l-r的核苷酸序列如seq id no.5所示；

14、针对d451a点突的突变引物d451a-f和d175a-r，所述d451a-f的核苷酸序列如包括seq id no.6所示，所述d451a-r的核苷酸序列如seq id no.7所示；

15、针对d451l点突的突变引物d451l-f和d175l-r，所述d451l-f的核苷酸序列如包括seq id no.8所示，所述d451l-r的核苷酸序列如seq id no.9所示；

16、针对t194a点突的突变引物t194a-f和d175a-r，所述t194a-f的核苷酸序列如包括seq id no.10所示，所述t194a-r的核苷酸序列如seq id no.11所示；

17、针对t194l点突的突变引物t194l-f和d175l-r，所述t194l-f的核苷酸序列如包括seq id no.12所示，所述t194l-r的核苷酸序列如seq id no.13所示；

18、针对d457a点突的突变引物d457a-f和d175a-r，所述d457a-f的核苷酸序列如包括seq id no.14所示，所述d457a-r的核苷酸序列如seq id no.15所示；

19、针对d457l点突的突变引物d457l-f和d175l-r，所述d457l-f的核苷酸序列如包括seq id no.16所示，所述d457l-r的核苷酸序列如seq id no.17所示；

20、针对t194i点突的突变引物t194i-f和d175a-r，所述t194i-f的核苷酸序列如包括seq id no.18所示，所述t194i-r的核苷酸序列如seq id no.19所示；

21、针对t194v点突的突变引物t194v-f和d175a-r，所述t194v-f的核苷酸序列如包括seq id no.20所示，所述t194v-r的核苷酸序列如seq id no.21所示；

22、针对t194m点突的突变引物t194m-f和d175a-r，所述t194m-f的核苷酸序列如包括seq id no.22所示，所述t194m-r的核苷酸序列如seq id no.23所示；

23、针对t194f点突的突变引物t194f-f和d175a-r，所述t194f-f的核苷酸序列如包括seq id no.24所示，所述t194f-r的核苷酸序列如seq id no.25所示；

24、针对t194c点突的突变引物t194c-f和d175a-r，所述t194c-f的核苷酸序列如包括seq id no.26所示，所述t194c-r的核苷酸序列如seq id no.27所示；

25、针对t194p点突的突变引物t194p-f和d175a-r，所述t194p-f的核苷酸序列如包括seq id no.28所示，所述t194p-r的核苷酸序列如seq id no.29所示。

26、优选的，作为一种改进，步骤(3)所述pcr扩增程序包括：98℃预变性5min；98℃变性10s，55～65℃退火30s，72℃延伸2min，以1min/kb进行延伸，30循环；72℃延伸10min；4℃保持。

27、优选的，作为一种改进，步骤(5)中所述重组菌与40％的甘油1:1混合后于-80℃环境备用。

28、优选的，作为一种改进，所述步骤(1)中采用lb培养基于37℃，200rpm条件下培养12h。

29、本发明还提供了上述磷脂酶d表达重组菌制备磷脂酶d的方法，包括以下步骤：所述磷脂酶d表达重组菌用lb培养基复苏后，转接于tb培养基中培养5-6h，再转接至tb调整培养基中，加入诱导剂，诱导磷脂酶d的表达。

30、优选的，作为一种改进，所述诱导剂包括：阿拉伯糖、dtt、乙醇、丁醇和抗生素，所述阿拉伯糖浓度为0.035％·od600-1，加入所述诱导剂到tb调整培养基后，于18℃摇床，200rpm，诱导表达16h。

31、本方案提供了一种磷脂酶d的突变蛋白，所述突变蛋白利用pld(2ze4)与文献报道的来源于streptomyces sp.pmf，pdb编号为1v0s的pld进行氨基酸序列比对,确定酶的活性中心线，再将酶的活性中心及活性位点附近的氨基酸突变成疏水性氨基酸，利用软件autodock vina将pld(2ze4)分别与底物pc和l-ser进行分子对接，确定底物分子与酶分子的绑定位点，再将pld上的绑定位点的氨基酸突变成疏水性氨基酸，达到抑制pld的水解酶活及增大pld与底物结合部位的口袋大小。本方案与原始菌株相比，将d175、s451、t194、s457四个点位的氨基酸突变成a和l后，磷脂酶d的水解活性明显降低，即将绑定位点氨基酸突变成疏水氨基酸可以一直pld的水解酶活性；其中s457a、d175a、s451a和s457l、d175l、s451l几乎无转酰基活性，不能将pc转化成ps；t194a和t194l合成ps的产率显著提高，在相同的反应条件下，其ps产率由27.46％提高到53.56和49.23％。