一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与应用与流程

本发明涉及一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与应用，属于微生物。

背景技术：

1、依克多因，化学名称为1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，又称四氢嘧啶，是一种环状氨基酸衍生物，是微生物为适应一系列恶劣环境而产生的一种天然保护性物质，广泛分布在嗜盐菌、真菌以及盐藻细胞中。四氢嘧啶经试验证实具有抗紫外、补水保湿和对反应性皮炎、神经性皮炎有一定的治疗效果。四氢嘧啶这几年应用十分广泛，在生物保护、生物医药和科技领域都有一席之地。由于化学合成四氢嘧啶的前体物价格昂贵，且四氢嘧啶分子中有一个手性碳原子，所以很难用化学法合成，目前四氢嘧啶的主要生产方法为发酵法和酶催化法。

2、目前所报道的专利和文献中，生产四氢嘧啶所采用的方法为“挤奶法”，即在低盐浓度中培养，用高浓度盐多次低渗冲击获得比较高的四氢嘧啶产量。但是该方法对设备要求高，高盐浓度对设备损害大，而且在高-低盐浓度的多次冲击下，细胞后期几乎不再生长，以及不产生四氢嘧啶，四氢嘧啶产量仅在10～15g/l。天津科技大学通过改造谷氨酸棒杆菌获得的基因工程菌，在发酵条件下可得到四氢嘧啶21g/l。但是该实验操作过程复杂，可复制性较低，且产物为四氢嘧啶衍生物，后期需要进一步的分离提取纯化，生产成本高。

3、因此筛选获得较低盐浓度下生长发酵，且生成四氢嘧啶的菌株对于四氢嘧啶的工业化生产具有重要的意义。

技术实现思路

1、一株高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(virgibacillusdokdonensis)vd2211，于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no.m 20221944。

2、根据本发明优选的，所述嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211的16s rdna的基因序列如seq idno.1所示。

3、根据本发明优选的，所述嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211是以菌种yt-357为出发菌株，经he-ne激光诱变、紫外诱变和亚硝基胍诱变后得到。

4、进一步优选的，所述he-ne激光诱变为：使用波长为632.8nm，光斑直径为1.5mm的he-ne激光器照射25min，照射距离为25cm，输出功率为15mw。

5、进一步优选的，所述紫外诱变为：在离紫外灯5～10cm位置处照射30s。

6、进一步优选的，所述亚硝基胍诱变为：添加终浓度为0.75g/l的亚硝基胍。

7、上述嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211的培养方法，步骤如下：

8、(1)取嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211接种至种子培养基中，在摇床转速为200～240rpm、29～38℃下培养24～36h，得到种子液；

9、(2)将种子液按照5～10％的接种量接入发酵培养基中，在摇床转速为200～240rpm、29～38℃下发酵培养48～96h，得到嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211的菌液。

10、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述种子培养基组分为：葡萄糖10-30g/l，酵母粉5-10g/l，柠檬酸1-3g/l，氯化钾2-4g/l，磷酸氢二钾5-10g/l，七水硫酸镁10-20g/l，氯化钠10-30g/l，硫酸铵10-20g/l，ph 7.0～7.4。

11、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述发酵培养基组分为：氯化钠30-80g/l，七水硫酸镁5-15g/l，氯化钾2-5g/l，植物水解蛋白20-40g/l，硫酸铵10-20g/l，磷酸氢二钾5-10g/l，柠檬酸1-5g/l，葡萄糖10-50g/l，ph 7.0～7.4。

12、上述嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211在生产四氢嘧啶中的应用。

13、有益效果：

14、1、本发明通过筛选和诱变得到一株高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(virgibacillusdokdonensis)vd2211，它可以在盐浓度为30～80g/l的条件下生长和持续发酵，并且能够产生四氢嘧啶，其发酵液中四氢嘧啶最高积累量达到20～22g/l。该菌株可以应用于四氢嘧啶的大规模工业化生产中，提高四氢嘧啶的产量，降低四氢嘧啶的成本。

15、2、本发明提供的高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(virgibacillusdokdonensis)vd2211可以在较低盐浓度下生长发酵，无需使用高浓度盐就可以产生四氢嘧啶，可以减少发酵设备耐盐度的要求，进一步降低四氢嘧啶的生产成本。

技术特征：

1.一株高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(virgibacillusdokdonensis)vd2211，于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no.m 20221944。

2.如权利要求1所述的嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211，其特征在于，所述嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211是以菌种yt-357为出发菌株，经he-ne激光诱变、紫外诱变和亚硝基胍诱变后得到。

3.如权利要求2所述的嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211，其特征在于，所述he-ne激光诱变为：使用波长为632.8nm，光斑直径为1.5mm的he-ne激光器照射25min，照射距离为25cm，输出功率为15mw。

4.如权利要求2所述的嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211，其特征在于，所述紫外诱变为：在离紫外灯5～10cm位置处照射30s。

5.如权利要求2所述的嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211，其特征在于，所述亚硝基胍诱变为：添加终浓度为0.75g/l的亚硝基胍。

6.权利要求1所述的嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211的培养方法，其特征在于，步骤如下：

7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养基组分为：葡萄糖10-30g/l，酵母粉5-10g/l，柠檬酸1-3g/l，氯化钾2-4g/l，磷酸氢二钾5-10g/l，七水硫酸镁10-20g/l，氯化钠10-30g/l，硫酸铵10-20g/l，ph 7.0～7.4。

8.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养基组分为：氯化钠30-80g/l，七水硫酸镁5-15g/l，氯化钾2-5g/l，植物水解蛋白20-40g/l，硫酸铵10-20g/l，磷酸氢二钾5-10g/l，柠檬酸1-5g/l，葡萄糖10-50g/l，ph 7.0～7.4。

9.权利要求1所述的嗜盐独岛枝芽孢杆菌vd2211在生产四氢嘧啶中的应用。

技术总结
本发明涉及一种高产四氢嘧啶的嗜盐独岛枝芽孢杆菌及其培养方法与应用。本发明中的嗜盐独岛枝芽孢杆菌(Virgibacillusdokdonensis)VD2211，于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号CCTCC NO.M 20221944。该菌株可以在盐浓度为30～80g/L的条件下生长和持续发酵，并且能够产生四氢嘧啶，其发酵液中四氢嘧啶最高积累量达到20～22g/L。该菌株可以应用于四氢嘧啶的大规模工业化生产中，提高四氢嘧啶的产量，降低四氢嘧啶的成本。

技术研发人员：苏移山,朱云峰,张兆倩,张雨晴,朱希强
受保护的技术使用者：山东丰金美业科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13