一种基于多重PCR方法的检测Y染色体AZF区域非整倍性变化的试剂盒与流程

本发明涉及基因检测，尤其涉及一种基于多重pcr方法的检测y染色体azf区域非整倍性变化的试剂盒。

背景技术：

1、人类y染色体上携带着负责睾丸发育、男性特征、精子形成与维持的多个基因，这些基因所在区域也称为azf区域，其中，azf区域所在的y染色体长臂(yq)含有许多重复区域和回文区域、在精子发生过程中容易发生自发重组和染色体局部或者整体的缺失，现在的研究表明，azf区域的异常变化会导致男性不孕不育、精子数目和形态异常、女性反复流产、胚胎发育不良等临床症状。

2、研究资料显示，在对近4万条y染色体状态的统计分析中发现，全球不育男性中azf微缺失的患病率为7.5％，而且azf缺失所引起的症状具有人种差异，例如欧洲男性对yq微缺失的易感性较低，美国和东亚男性的患病率最高。azf区域又分为azfa、azfb、azfc、azfd等4个小区，特别是azfc位点的部分缺失虽然与不育有关，但其影响范围却与种族有关。4个不同的小区有根据对染色物质的敏感度不同进一步区分为b/b，gr/gr等回文区域，在对男性的17000条y染色体的分析表明，白种人和蒙古男性的gr缺失与男性不育有关，而非洲和德拉威人的b2/b3缺失与男性不育有关。

3、有研究表明，有2.5％～7％的精子会发生染色体级别的非整倍性变化，累及13、15、21、22、x和y等多条染色体。在70项不同研究的总共747个正常男性精液中，含有xx、xy和yy的单个精子的比例分别是0.09％、0.21％和0.12％，整体来看，在精液样本中全部染色体的累积二体率为3.99％～4.28％。50％的少精子症患者、33.3％的少弱精子症患者和21％的少弱畸形精子症患者精子染色体畸形率升高的比例最高，36％的核型异常和26％的减数分裂异常患者精子的非整倍体率高。

4、在一项比较不同非整倍率男性的单精子显微注射(icsi)临床结局的研究中(如下图所示)，可以观察到精液整体非整倍性只有1％～5％的变化(x/y的非整倍性变化为0.12％)的10名男性能够正常生育，相当于是正常对照；对9名精液整体非整倍性为3.91％变化(x/y的非整倍性变化为0.67％)的男性进行单精子显微注射(icsi)，为获得生化妊娠，进行至少4次icsi，移植胚胎数2-11枚；对10名精液整体非整倍性为9.02％变化(x/y的非整倍性变化为1.29％)的男性进行单精子显微注射(icsi)，为获得生化妊娠，进行超过4次icsi，移植胚胎数6-19枚；该项研究说明，染色体非整倍性的小幅变化(4％～8％，其中性染色体变化0.54％～1.16％)就能极显著的影响妊娠结局，需要的icsi次数更多、移植的胚胎数更多才能获得生化妊娠。研究统计发现：精子二体率＜4.84％，至少可获得一个整倍体胚胎，预测率75.6％；精子二体率每减少1％，得不到整倍体胚胎的风险降低2.071倍。

5、鉴于azf区域的重要性，当前已经有多种技术方法可以检测azf区域的缺失和变化，比如在qpcr平台建立的针对6个、8个甚至更多sts位点的检测方法，此类检测方案简单易行、成本便宜，但本质上是以点带面，只能区分有和无的情况，漏检率高，因此更进一步发展起来了基于多重pcr或者特异性连接法的毛细管电泳或者测序的方案，能够进一步提高检测的精度，再进一步的方案是基于azf区域目标捕获富集的二代测序方法，捕获探针更加密集，覆盖的位点更多，能够检测部分缺失的情况，即同一个样本中有些精子缺失了azf区域、有些精子没有缺失的情况，在检测结果中，y的拷贝数并不是1，而是非整倍的数值，进一步降低了漏检率，为不孕不育的生物学研究提供了更多的数据，但基于二代测序技术的azf区域检测方法对拷贝数变化的灵敏度不高，只能区分20％～30％的拷贝数变化，即0.7～1.3个拷贝会被认为是正常，无法区分10％以下甚至1％的拷贝数变化。当前在代表性的专利中，技术参数与特点如下表所示：

6、

7、综上所述，精子染色体的非整倍性，包括y染色体的非整倍性与辅助生殖的临床结局具有显著的相关性，目前临床上急需一种通量高、操作相对简单、周期较短、利于临床推广的精子非整倍体检测试剂盒。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于多重pcr方法的检测y染色体azf区域非整倍性变化的试剂盒。

2、本发明的第一个目的是提供一种基于多重pcr方法的检测y染色体azf区域非整倍性变化的试剂盒，所述试剂盒中包括：

3、n1重设置在y染色体的引物，记作yplex，

4、n2重设置在x染色体上的引物，记作xplex，

5、n3重设置在常染色体上的引物，记作ipcplex，

6、n4重设置在par区域的引物，记作parplex，

7、n5重设置在indel类型snp上的引物，记作indelplex；

8、其中，yplex、xplex、ipcplex、parplex和indelplex中又各自分成fp组、rpin组和rpout组，具体反应中需要包括至少其中的一组，最优组合在于实现检测到y染色体azf区域1％的非整倍性变化。

9、进一步地，所述的fp组、rpin组和rpout组满足：

10、在盐浓度为0.25mol/l、温度为55℃时，fp组、rpin组和rpout组的吉布斯自由能δg在-20.7073kcal/mol≤δg≤-44.6782kcal/mol范围内。

11、进一步地，目的检测限、dna投入量、pcr重数以及所需的测序数据量符合以下数学模型：

12、可用来计算非整倍性变化的分子个数cm＝di×pl×150；

13、理论检测灵敏度s＝sqrt(cm)/cm；

14、预估检测下限sl＝8.01/sqrt(cm)；

15、预估测序数据量(m reads)＝di×600×pl×minread；

16、其中的150、8.01、600是本发明的实验经验系数；

17、其中di为dna投入量(ng)，pl为pcr重数，minread为预计最低reads个数/重(重指pcr重数)，sqrt为平方根。

18、进一步地，parplex fp组的序列如下：

19、

20、

21、

22、parplex rpin组的序列如下：

23、

24、

25、

26、parplex rpout组的序列如下：

27、

28、

29、进一步地，yplex fp组的序列如下：

30、

31、

32、

33、

34、

35、

36、yplex rpin组的序列如下：

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39、

40、

41、

42、

43、yplex rpout组的序列如下：

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46、

47、

48、

49、

50、进一步地，ipcplex fp组的序列如下：

51、

52、

53、ipcplex rpin组的序列如下：

54、

55、ipcplex rpout组的序列如下：

56、

57、进一步地，indelplex fp组的序列如下：

58、

59、

60、indelplex rpin组的序列如下：

61、

62、

63、indelplex rpout组的序列如下：

64、

65、

66、进一步地，xplex fp组的序列如下：

67、

68、

69、xplex rpin组的序列如下：

70、

71、

72、xplex rpout组的序列如下：

73、

74、进一步地，其中h＝c/a/t碱基中的一种，hhhhhhhhhhhhhhh被称之为umi序列。δg通过m1序列进行调节，m1序列为ttctt或tatca。

75、进一步地，通用引物序列如下：

76、

77、进一步地，fp、rpin、rpout组需要配合使用，其特征在于相同plex id的fp、rpin和rpout需要在流程中配合使用才能取得技术效果。

78、进一步地，典型的操作流程为：

79、s1、选择将dna样本进行打断，片段长度主范围集中在150～250bp附近。样本类型可以是组织dna、外周血dna、体液游离dna、细胞系基因组dna等。

80、s2、取20ng打断dna样本，混合rpout组，fp组和通用pcr引物组ufp+urp，进行umipcr和通用pcr，纯化得到产物1。

81、s3、向产物1中混合rpin组引物和ufp引物(合称半巢式pcr引物)，对产物1进行半巢式pcr，纯化得到产物2；

82、s4、向产物2中混合index pcr引物组，对产物2进行index pcr，纯化得到产物3；其中，index pcr引物组为《multiplex oligos for(dual indexprimers set 1)》商用试剂盒中的组分；

83、s5、对产物3进行荧光定量，合格后上机测序，下机数据质控，生信分析，计算均一化p之后，不同样本的不同目标区域的p值便具有了可比性。

84、进一步地，完成本方案的典型操作流程之后进行二代测序，下机数据质控合格后，去除接头，进行比对分析，去掉umi序列含有g碱基和小于3个umi counts的umi序列种类，然后计算出每一重plex的umi序列种类的数量，用ipcplex中的至少一重做均一化，计入均一化方法的区域还需要符合0.02cm<umi序列种类<10cm。均一化计算公式为：

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86、其中，内参区域可以是ipcplex、indelplex、parplex组的部分或全部，也可以是xplex或yplex组的部分或全部。

87、进一步地，为了实现整体的技术效果，还需要umi pcr引物组(rpout组和fp组)，优选序列如下，umi pcr引物组的浓度为1-500nm，通用pcr引物浓度为1-100μm，半巢式pcr引物浓度为1-100μm，index pcr引物浓度为1-100μm。其他包括dna聚合酶1dntp，dna聚合酶2，dna聚合酶3，纯水，阴性对照，磁珠。dna聚合酶1优选：high-fidelity dnapolymerase(neb)；kod-plus-neo(toyobo)；次优选：high-fidelity dnapolymerase(neb)；takara la(takara)。dna聚合酶2优选：powerup sybr green预混液(thermofisher)；kapa hifi hotstart readymix pcr kit(roche)；high-fidelity pcrkits(bio-rad)；次优选：2×max master mix(dye plus)(诺唯赞)；dna聚合酶3优选：powerup sybr green预混液(thermofisher)；kapahifi hotstart readymix pcr kit(roche)；high-fidelity pcr kits(bio-rad)；次优选：2×max master mix(dyeplus)(诺唯赞)。

88、本发明的第二个目的是提供上述试剂盒在制备生殖检测产品中的应用。

89、借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

90、本发明提供了一种利用多重pcr检测精子二体率和y染色体非整倍性微小拷贝数变化的方法和试剂盒，检测灵敏度在1％左右，检测下限在5％，高于当前行业20％～30％的灵敏度水平。本专利公开的方法与试剂盒可以通过检测精子的非整倍性微小变化，预测后续辅助诊断的临床结局，提前规避生育风险。本发明公开的技术实现了当前常规技术所不能实现的检测目的，所公开的技术参数超当前常规技术的技术指标4-30倍，具有极大的创新性。

91、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。