一种重组腺相关病毒载体及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体涉及一种重组腺相关病毒载体及其应用。

背景技术：

1、脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,sma)是一种由存活运动神经元1基因(survival motor neuron 1gene,smn1)缺失或突变引起的常染色体隐性遗传疾病，主要以脊髓前运动神经元退化变性导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征。sma常累及呼吸系统，引起呼吸系统病理生理改变，导致低通气、咳嗽减弱、痰液堵塞等一系列呼吸问题。呼吸衰竭是sma患儿最常见的致死原因。该病在欧美人群存活新生儿中的发病率约为1:10 000，位居2岁以下儿童致死性遗传病的首位。

2、位于着丝粒侧的smn2基因与端粒侧smn1基因具有高度同源性，仅在各自的3'端有5个单核苷酸的差别。smn2基因的缺失虽不致病，但其是smn1基因的修饰基因，在smn1基因缺失的情况下起着剂量补偿作用，smn2拷贝数与sma表型严重程度相关。根据发病年龄、肌无力严重程度和达到的运动功能，sma可分为4种常见临床类型，分别为sma-ⅰ型、sma-ⅱ型、sma-ⅲ型和sma-ⅳ型。i型sma也称werdnig-hoffman病，即婴儿型，约占全部sma病例的45％。患儿出生6个月内发病，出现迅速发展的进行性、对称性四肢无力，最大运动能力不能达到独坐。多数患儿在2岁内死于呼吸衰竭。ⅰ型sma患儿的smn2拷贝数以2拷贝者居多。ii型sma也称dubowitz病，即中间型，约占30％～40％。患者多在出生后6～18个月发病，进展较i型慢，最大运动能力可达到独坐，不能独站活独走。多数可以活到成年期。ⅱ型的smn2拷贝数以3拷贝者居多。ⅲ型也称kugelberg-welander病，即青少年型，约占20％。患者多数在出生18个月以后发病，早期运动发育正常，能够独走。随着年龄的增长出现以近端为主的肌无力，最终部分丧失独走能力。患者寿命不缩短或轻度下降。ⅲ型的smn2拷贝数以3或4拷贝者居多。ⅳ型，晚发型，即成人型。患者早期运动发育正常，成人后发病，出现肢体近端无力，轻微运动障碍，病情进展缓慢，寿命一般不受影响。ⅳ型的smn2拷贝数以4拷贝者为主。

3、目前，在依赖smn的治疗策略中，主要包括smnl基因替代治疗、增强smn2基因启动子活性、增加smn2基因全长转录本的表达等。进入临床试验阶段的药物包括苯基丁酸、丙戊酸和羟基脲等，但并没有产生足够的临床效益。fda批准的诺西那生钠(spinraza)，一种反义寡核苷酸(aso)药物，旨在通过调节smn2基因的剪接来增加全长smn蛋白的产量，从而弥补潜在的遗传缺陷。临床研究显示，有望改善运动障碍；然而，这种治疗方法必须通过鞘内注射无限期地给药，在生效前需要很长的诱导期，并有需要临床监测的安全性考虑。fda批准的zolgensma通过aav9载体将自身互补的双链smn1表达序列递送到体内，并在巨细胞病毒(cmv)即刻/早期增强子和鸡β-肌动蛋白(cb)启动子的调控作用下已达到治疗的目的，但就目前的临床数据来看，针对sma患者治疗效果有待提升。

4、腺相关病毒(aav)是细小病毒科的一种，对于体内递送遗传物质有很大潜力。aav载体系统是一种备受欢迎的体内外基因传递系统，对哺乳动物多种类型细胞具有高效的转导效率。在包装细胞中，位于两个反向重复序列(itrs)之间的dna片段与辅助质粒表达的病毒蛋白在包装细胞中包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时，携带外源dna的aav病毒进入细胞，线性双链dna基因组以游离dna的形式存在于细胞核中。根据病毒表面衣壳蛋白的不同将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性。其中，aav9对心肌、肺、视网膜、皮肤等组织具有亲和性。此外，由于aav9具有跨血脑屏障的能力，在神经科学领域应用广泛。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种重组腺相关病毒载体及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种重组腺相关病毒载体，包含腺相关病毒衣壳和序列元件，所示序列元件包括efs启动子序列和编码运动神经元存活蛋白的序列。

4、本发明提供的重组腺相关病毒载体能够避免smn1的过度表达所导致的毒性反应，将体内的smn1蛋白水平稳定维持在药物治疗窗内，能够延长sma小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育。

5、作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述efs启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述运动神经元存活蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

7、作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述编码运动神经元存活蛋白的序列由seq id no.4和seq id no.5所示的引物组以hsmn1cdna为模板克隆而得。

8、作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述神经元存活蛋白的基因为smn1基因，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

9、作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，还包括wpre序列、kozak序列、多聚腺苷酸序列、aav反向末端重复序列中的至少一种。

10、作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述aav反向末端重复序列包含aav 5’-itr和aav3’-itr。

11、作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述腺相关病毒衣壳为aavphp.eb、aavphp.b和aav9衣壳中的任意一种。

12、第二方面，本发明提供一种药物组合物，包括上述的重组腺相关病毒载体。

13、优选的，所述药物组合物还包括任一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

14、进一步的，所述药物组合物的给药方式为注射；

15、更进一步的，所述注射为静脉注射、脑室注射和鞘内注射中的至少一种。

16、第三方面，本发明将所述的重组腺相关病毒载体、所述的药物组合物在制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物中应用。

17、优选的，所述神经系统疾病为涉及运动功能的运动神经元疾病。

18、本发明采用基因治疗的策略，通过efs启动子调控smn1基因表达，恢复神经元的生理功能，显著延长sma小鼠模型的生存期。可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。

19、进一步的，所述运动神经元疾病包括脊髓性肌萎缩、肌萎缩性侧索硬化症、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化和外伤性脊髓损伤。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

21、本发明的重组腺相关病毒载体能够避免smn1的过度表达所导致的毒性反应，将体内的smn1蛋白水平稳定维持在药物治疗窗内，能够延长sma小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育。本发明采用基因治疗的策略，通过efs启动子调控smn1基因表达，恢复神经元的生理功能，显著延长小鼠模型的生存期。相比于前述已有的基于aav载体的sma基因治疗策略，特别是fda批准的zolgensma，本发明独特的smn1表达框设计能够在治疗sma的同时避免外源基因过表达带来安全性风险，避免出现由于smn持续性过表达引起的运动神经元延迟性退行性病变，尤其是基于cmv(human cytomegalovirusimmediate early enhancer/promoter,人巨细胞病毒即刻早期增强型启动子)启动子衍生出的cb系列启动子或者cag系列启动子，这些启动子可以让其所控制的人smn1基因序列在体内一直保持高水平表达。本发明提供的重组腺相关病毒载体治疗sma的效果显著优于包含其他启动子的重组腺相关病毒载体。可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。