一种重组蛋白及其制备方法和在牛结核病检测中的应用与流程

本发明涉及生物，具体的，涉及一种重组蛋白及其制备方法和在牛结核病检测中的应用。

背景技术：

1、牛结核病是由分支杆菌属牛分支杆菌引起的一种慢性疾病，以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征，具有剧烈传染性，我国将其列为二类动物疫病。19世纪后期，科赫设计了著名的结核菌素皮肤试验，是目前被世界动物卫生组织认可的检测牛结核病的手段，在我国广泛用于牛结核病的诊断和流行病学调查，但经典的ppd（结合菌素）因所含抗原成分复杂导致特异性较差，大多数抗原为分枝杆菌属所共有，与环境分枝杆菌存在交叉反应，容易导致假阳性检测结果。其次，结核菌素作为结核分枝杆菌次级产物，生产周期至少需要6个月，且培养结核分枝杆菌需体外多次传代，可能产生菌失活、基因缺失、遗传背景不清楚等现象，导致不同批次结核菌素检测效力不均一，这些因素都可能影响结核菌素皮肤试验的检测结果。

2、随着时代的进步，结核菌素的生产工艺不断优化，增加了产量的同时也保证了产品的稳定性，但结核菌素的本质没有变，其中依然含有200多种抗原，导致其诊断的特异性较差，大多数抗原为卡介苗所共有，不能够区分出是自然感染牛还是卡介苗接种牛，从而严重干扰牛结核病阳性结果的判定，而卡介苗在世界范围内广泛接种，这一举措会干扰了结核菌素皮肤试验的检测，导致检查出假阳性的动物被淘汰，对养殖户造成严重的经济损失。

3、结核菌素至今已有近百年的历史，随着对结核病的不断深入，天然cfp10和esat6蛋白具有较强的细胞免疫活性。有文献报道esat-6、cfp-10具有高度保守性，并加强了这两种抗原在牛结核病诊断中的应用。其次，研究发现这两种蛋白均能诱发迟发性变态反应，具有较好的诊断潜力。更重要的是，esat6和cfp10基因在卡介苗基因中缺失，使用这两种蛋白可以区分结核分支杆菌感染还是卡介苗株感染，在体外诊断中具有较高的特异性，与结核菌素相比特异性高达93%，但灵敏度只有73%，导致esat6-cfp10重组蛋白（即ec）检测牛结核病的效果不理想。

4、目前，国内也有发现用ec法进行的检测产品，即重庆智飞生物的“宜卡”，应用的是重组蛋白esat6-cfp10，用于人的结核分枝杆菌感染的检测。此产品将结核分枝杆菌早期分泌性低分子量蛋白esat6和cfp10融合在一起，通过原核表达系统表达了重组蛋白esat6-cfp10。此产品只是表达了重组蛋白esat6-cfp10，但未解决其灵敏度低的问题，esat-6和cfp-10两种蛋白对牛结核病的检测效果依旧次于结核菌素。

技术实现思路

1、本发明提出一种重组蛋白及其制备方法和在牛结核病检测中的应用，解决了现有技术中ec法检测牛结核病时灵敏度低的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提出了一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明还提出了一种编码所述重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seq idno.2所示。

5、作为进一步的技术方案，所述重组蛋白包括串联组合的esat-6、cfp-10和bfh。

6、作为进一步的技术方案，所述esat-6的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述cfp-10的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述bfh的氨基酸序列seq id no.5所示。

7、作为进一步的技术方案，所述esat-6、cfp-10和bfh用linker按照esat-6-cfp-10-bfh的方式串联组合，所述linker的氨基酸序列seq id no.6所示。

8、本发明还提出了所述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

9、（1）分别将esat-6、cfp-10和bfh的氨基酸序列进行密码子优化；

10、（2）用linker按照esat-6-cfp-10-bfh的方式将优化后的esat-6、cfp-10和bfh串联组合，得到合成基因ec-bfh；

11、（3）将合成基因ec-bfh插入原核表达载体pet 28a，得到ec-bfh表达载体；

12、（4）将ec-bfh表达载体转入蛋白表达菌株，表达、纯化后得到重组蛋白。

13、作为进一步的技术方案，所述蛋白表达菌株为bl21（de3）大肠杆菌菌株。

14、作为进一步的技术方案，所述纯化时采用尿素变性和复性。

15、作为进一步的技术方案，所述尿素变形和复性包括以下步骤：

16、（1）菌体破碎及蛋白变性：将表达后得到的菌体用含尿素的结合缓冲液重悬，用细胞破碎仪超声破碎菌体，离心，收集上清液；

17、（2）蛋白纯化：采用亲和层析法进行蛋白纯化：将上清液与填料孵育5-20min后，用洗涤缓冲液洗涤除去杂蛋白，用洗脱缓冲液将蛋白洗脱；

18、（3）蛋白复性：采用透析法将洗脱液中的尿素透析除去，得到重组蛋白。

19、作为进一步的技术方案，所述结合缓冲液的配方为：20 mm pb，200 mm nacl，10mm咪唑，尿素2~6 m，溶液ph7.4；

20、所述洗涤缓冲液的配方为：20 mm pb，200 mm nacl，150 mm咪唑，尿素2~6 m，溶液ph7.4；

21、所述洗脱缓冲液的配方为20 mm pb，200 mm nacl，400 mm咪唑，尿素2~6 m，溶液ph7.4。

22、作为进一步的技术方案，采用透析法将洗脱液中的尿素透析除去的具体操作为：先依次用处理液1和处理液2处理透析袋，然后将洗脱液转移至透析袋内，放入复性液中透析。

23、作为进一步的技术方案，所述处理液1的配方为：2％碳酸氢钠、1 mm edta，溶液ph8.0；

24、所述处理液2的配方为：10 mm edta，溶液ph8.0；

25、所述复性液的配方为：20 mm pb，其中0.1m pb的配方为：为77.4 ml 1m na2hpo4，22.6 ml 1m nah2po4，去离子水定容至1l，溶液ph7.4。

26、本发明还提出了所述重组蛋白在制备检测或诊断牛结核病试剂中的应用。

27、作为进一步的技术方案，所述检测或诊断牛结核病试剂包括所述重组蛋白，还包括低分子量透明质酸。

28、本发明还提出了所述重组蛋白在制备牛结核病检测试剂盒中的应用。

29、本发明的工作原理及有益效果为：

30、结核菌素试验是一种以ⅳ型变态反应原理为基础的皮肤试验，其中树突状细胞（dc细胞）是功能最强的专职抗原呈递细胞，具有独特的刺激t细胞增殖的能力，是机体免疫应答的始动者。该反应的强度依赖于皮下dc细胞吞噬、消化并递呈抗原的效率。

31、1、本发明中，将esat-6和cfp-10蛋白融合于牛铁蛋白重链（bfh）上，形成重组蛋白ec-bfh，将铁蛋白形成的24聚抗体作为抗原骨架，提高抗原的分子量，增强免疫原性，促进dc细胞吞噬，从而提高了ec法检测牛结核病的灵敏度。应用牛源的铁蛋白重链，还可避免因异源引起的免疫反应，避免产生假阳性，从而提高检测的准确度。

32、2、本发明中，制备重组蛋白ec-bfh时采用尿素变性和复性对蛋白纯化，有效避免了ec-bfh原核表达时形成包涵体的现象，纯化方法操作简单，即提高了纯化效率又保证了蛋白纯度，使制备的重组蛋白纯度达到90%以上。

33、3、本发明中，添加低分子量透明质酸作为免疫增强剂，低分子量透明质酸可以促进dc细胞成熟，提高dc细胞对抗原呈递能力，进而增强了利用ec法检测牛结核分支杆菌感染时的敏感度以及皮试的反应效果。

34、4、本发明中，检测或诊断牛结核病试剂包括重组蛋白ec-bfh，还包括低分子量透明质酸，重组蛋白ec-bfh分子量大，从而提高促进dc细胞吞噬抗原的效率，低分子量透明质酸促进dc细胞成熟，从而提高dc细胞对抗原的呈递能力，因此，二者结合，从促进dc细胞吞噬和促进dc细胞呈递抗原两个方面解决了现有技术中ec法检测牛结核病时灵敏度低的问题。