用于癌症筛查的基于m1A相关miRNA诊断试剂、模型及制备方法

本发明涉及生物医学，特别地涉及用于癌症筛查的基于m1a相关mirna诊断试剂、模型及制备方法。

背景技术：

1、大多数新发癌症病例通常发现在晚期，使患者失去了最佳治疗机会，导致预后不良。癌症的早期诊断对于降低癌症死亡率、延长患者生存期、减轻社会负担具有重要意义。由于现有癌症筛查方法存在成本高、侵入性强和准确率低等缺陷，基于这些现有方法进行大规模癌症筛查既不可行，也不具有成本效益。近年来，循环肿瘤dna(circulating tumordna，ctdna)在大规模的癌症筛查中展现出极大的临床应用前景，但其敏感性还有待提高。因此，迫切需要开发一种更有效和低侵入性、低成本的新型生物标志物，用于大规模癌症筛查。

2、m1a是哺乳动物中最常见的rna修饰类型之一，由甲基转移酶、去甲基酶和结合蛋白调节，分别被称为“编码器(writer)”、“消码器(eraser)”和“读码器(reader)”。m1a修饰水平的失调与肿瘤的发生和发展密切相关。有证据表明，m1a修饰异常介导的tp53突变，可以促进肿瘤的发生。ythdf1“读码器”通过与eif3c mrna结合，影响eif3c翻译，进而促进卵巢癌的发生和发展。在外周血中，m1a修饰对肿瘤的临床诊断、手术根治程度评估和预后预测具有重要的参考价值。胃癌患者癌组织的m1a修饰水平显著高于正常组织，且m1a修饰水平与肿瘤大小、胃癌tnm分期密切相关。m1a调控子(编码器、消码器和读码器)的表达受多种mirna的调节，并且这些mirna在肿瘤转移和进展中发挥了重要作用。mir-17-5p和mir-432可以直接靶向adar1(“编码器”)，抑制adar1的表达，促进黑色素瘤的转移和侵袭。adar1通过mirna-302a介导的irf9/stat1途径抑制胃癌中的干扰素信号传导。mir-451a能通过调控ythdc1(“读码器”)激活akt/mtor信号通路，进而促进骨肉瘤细胞的侵袭。血清中的循环mirna稳定性高且易检测，是肿瘤无创诊断的理想标志物。因此，开发基于血清中m1a-mirnas的新型诊断生物标志物是大规模癌症筛查的潜在策略。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在确定与m1a相关的mirna，并基于m1a-mirnas构建诊断模型应用于大规模癌症筛查。所构建的m1a-mirnas指标展示出了很高的准确性，并在区分癌症类型方面表现出优异的敏感性。m1a-mirnas指标的诊断性能不受性别、年龄和良性疾病的影响，并且适用于癌症的早期筛查。

2、本发明的一个目的是提供一种用于癌症筛查的的诊断试剂。

3、本发明所提供的用于癌症筛查的的诊断试剂，所述试剂包括选自seq id no.1至seq id no.20所示序列的rna(以下seq id no.1至seq id no.20中的“t”表示rna中的尿嘧啶)：

4、seq id no.1：agtatcgggacatgttacgacga；

5、seq id no.2：tcggataggacctaatgaactt；

6、seq id no.3：tacgggaaaattgtaacgtgac；

7、seq id no.4：ttgatatgttggatgatggagt；

8、seq id no.5：ccattagggaccgttacacta；

9、seq id no.6：ggatgcaaggtatcagatggt；

10、seq id no.7：gcggttataaatgcacgacgat；

11、seq id no.8：aggttagtcaaggactacgtcat；

12、seq id no.9：cctttagggaccgttacacta；

13、seq id no.10：acatttggtactacacgacgat；

14、seq id no.11：ttcgtaccttcgtgaat；

15、seq id no.12：cgaaactgttatgataacgtgac；

16、seq id no.13：ttgatatgttggaggatggagt；

17、seq id no.14：tcatgtagtagatatgacat；

18、seq id no.15：gatggacgtgatactcgtgaaac；

19、seq id no.16：tgggatattcgttataacgtgat；

20、seq id no.17：gatggacgtgacattcgtgaaac；

21、seq id no.18：ttagtcagagtaacgaaatatt；

22、seq id no.19：ggtgactttgtaccttcgtgaat；

23、seq id no.20：tccctaaggacccttttgacctg。

24、所述试剂包括seq id no.1至seq id no.20所示序列的rna：

25、seq id no.1：agtatcgggacatgttacgacga；

26、seq id no.2：tcggataggacctaatgaactt；

27、seq id no.3：tacgggaaaattgtaacgtgac；

28、seq id no.4：ttgatatgttggatgatggagt；

29、seq id no.5：ccattagggaccgttacacta；

30、seq id no.6：ggatgcaaggtatcagatggt；

31、seq id no.7：gcggttataaatgcacgacgat；

32、seq id no.8：aggttagtcaaggactacgtcat；

33、seq id no.9：cctttagggaccgttacacta；

34、seq id no.10：acatttggtactacacgacgat；

35、seq id no.11：ttcgtaccttcgtgaat；

36、seq id no.12：cgaaactgttatgataacgtgac；

37、seq id no.13：ttgatatgttggaggatggagt；

38、seq id no.14：tcatgtagtagatatgacat；

39、seq id no.15：gatggacgtgatactcgtgaaac；

40、seq id no.16：tgggatattcgttataacgtgat；

41、seq id no.17：gatggacgtgacattcgtgaaac；

42、seq id no.18：ttagtcagagtaacgaaatatt；

43、seq id no.19：ggtgactttgtaccttcgtgaat；

44、seq id no.20：tccctaaggacccttttgacctg。

45、所述癌症选自乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、神经胶质瘤、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肉瘤。

46、本发明还提供了一种用于癌症筛查的诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的用于癌症筛查的诊断试剂。

47、本发明还提供了一种癌症筛查模型的构建方法。

48、本发明所提供的癌症筛查模型的构建方法，包括如下步骤：

49、(1)筛选样本：从数据库中获取包含癌症的血清样本的mirna芯片测序数据；

50、(2)鉴定候选的m1a-mirnas：通过targetscan数据库得到与调控子相关的mirna，同时通过pubmed数据库检索m1a修饰相关的mirna；再通过ebayes检验进行差异分析，鉴定出高表达的m1a-mirna；最后通过lasso回归进行降维分析，筛选得到m1a-mirnas用于模型的验证；

51、(3)构建用于肿瘤筛查的模型：将所述步骤(1)中获取的血清样本随机分为训练集和测试集，用训练集样本基于支持向量机算法进行模型的构建；用验证集来判断模型的准确性；同时用所述步骤(2)筛选得到m1a-mirnas对模型进行验证。

52、所述步骤(1)中所述数据库为geo数据库，所述包含癌症的血清样本中癌症选自：乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、神经胶质瘤、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肉瘤。

53、所述步骤(2)中所述通过ebayes检验进行差异分析，鉴定出高表达的m1a-mirna，是以fdr<0.05，log|fold changes|>1.8为标准，筛选差异表达的m1a-mirnas。

54、所述步骤(2)中通过lasso回归进行降维分析后，还包括通过绘制roc曲线分析单个m1a-mirna对肿瘤的鉴别能力，挑选出在训练集和验证集中auc值均大于0.6的m1a-mirna。

55、通过lasso回归分析后，得到20个m1a-mirna，通过绘制单个m1a-mirna的roc曲线展示对肿瘤的鉴别能力，单个m1a-mirna的auc值无论在训练集还是验证集，auc值都大于0.6(训练集和验证集都是通过森林图展示单个m1a-mirna的auc值，图1中c和d)。

56、所述步骤(2)中通过lasso回归进行降维分析，筛选得到的m1a-mirnas包括选自seq id no.1至seq id no.20所示序列的rna：

57、seq id no.1：agtatcgggacatgttacgacga；

58、seq id no.2：tcggataggacctaatgaactt；

59、seq id no.3：tacgggaaaattgtaacgtgac；

60、seq id no.4：ttgatatgttggatgatggagt；

61、seq id no.5：ccattagggaccgttacacta；

62、seq id no.6：ggatgcaaggtatcagatggt；

63、seq id no.7：gcggttataaatgcacgacgat；

64、seq id no.8：aggttagtcaaggactacgtcat；

65、seq id no.9：cctttagggaccgttacacta；

66、seq id no.10：acatttggtactacacgacgat；

67、seq id no.11：ttcgtaccttcgtgaat；

68、seq id no.12：cgaaactgttatgataacgtgac；

69、seq id no.13：ttgatatgttggaggatggagt；

70、seq id no.14：tcatgtagtagatatgacat；

71、seq id no.15：gatggacgtgatactcgtgaaac；

72、seq id no.16：tgggatattcgttataacgtgat；

73、seq id no.17：gatggacgtgacattcgtgaaac；

74、seq id no.18：ttagtcagagtaacgaaatatt；

75、seq id no.19：ggtgactttgtaccttcgtgaat；

76、seq id no.20：tccctaaggacccttttgacctg。

77、所述步骤(2)中通过lasso回归进行降维分析，筛选得到的m1a-mirnas包括seq idno.1至seq id no.20所示序列的rna：

78、seq id no.1：agtatcgggacatgttacgacga；

79、seq id no.2：tcggataggacctaatgaactt；

80、seq id no.3：tacgggaaaattgtaacgtgac；

81、seq id no.4：ttgatatgttggatgatggagt；

82、seq id no.5：ccattagggaccgttacacta；

83、seq id no.6：ggatgcaaggtatcagatggt；

84、seq id no.7：gcggttataaatgcacgacgat；

85、seq id no.8：aggttagtcaaggactacgtcat；

86、seq id no.9：cctttagggaccgttacacta；

87、seq id no.10：acatttggtactacacgacgat；

88、seq id no.11：ttcgtaccttcgtgaat；

89、seq id no.12：cgaaactgttatgataacgtgac；

90、seq id no.13：ttgatatgttggaggatggagt；

91、seq id no.14：tcatgtagtagatatgacat；

92、seq id no.15：gatggacgtgatactcgtgaaac；

93、seq id no.16：tgggatattcgttataacgtgat；

94、seq id no.17：gatggacgtgacattcgtgaaac；

95、seq id no.18：ttagtcagagtaacgaaatatt；

96、seq id no.19：ggtgactttgtaccttcgtgaat；

97、seq id no.20：tccctaaggacccttttgacctg。

98、所述步骤(3)中所述基于支持向量机算法构建的模型是二分类模型，用如下公式寻找最优超平面：

99、

100、s.t.0≤αi≤c，i＝1,...,m

101、

102、本发明还提供了一种癌症筛查模型，是通过所述癌症筛查模型的构建方法构建得到。

103、本发明从geo数据库中下载正常人和癌症患者血清样本的mirna芯片测序数据，包括12种癌症类型(乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、神经胶质瘤、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肉瘤)，共16902个样本。同时下载对应的临床信息，包括年龄、性别等。通过数据库筛选及文献调研确定了80个m1a相关的mirna。

104、通过ebayes检验筛选在癌症样本中高表达的m1a-mirnas，共有32个(筛选条件为fdr<0.05，log|fold changes|>1.8)。再利用最小绝对收缩和选择算子(lasso)回归的方法进行降维分析，进一步得到了20个具有诊断潜力的候选m1a-mirna。

105、基于上述20个m1a-mirna，通过支持向量机算法(support vector machinealgorithm，svm)构建诊断模型，建立最终的m1a-mirna指标。通过与svm模型来判断样本是否为癌症样本，以及癌症的类型。此外，在i期和ii期的肿瘤患者中验证模型的有效性，并分析m1a-mirnas指标与患者年龄、性别等临床参数的关系。

106、我们所构建的m1a-mirnas指标在癌症筛查和癌症类型的鉴定中都展现出了极高的准确性，并且适用于癌症的早期筛查。此外，m1a-mirnas的诊断性能不受性别、年龄和良性疾病的影响。总之，m1a-mirnas指标是一个高精度、低成本、侵入性小的新型标志物，可以用于大规模癌症筛查。

107、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

108、(1)本发明所构建的m1a-mirnas指标可应用于大规模的癌症筛查(适用于最常见的12种癌症类型)，且模型的准确度高，auc值为0.974。根据auc值来判断模型的准确度，范围是0～1。当auc值>＝0.85时，说明模型效果好，越趋近于1，模型越好。

109、(2)本发明所构建的m1a-mirnas指标可进一步用于区分癌症类型，并表现出优异的敏感性，模型的auc值均大于0.720。模型的敏感性是根据诊断为阳性的正确率判断的，tpr＝tp/(tp+fn)，tpr表示阳性率、tp表示真阳性，fn表示伪阴性。

110、(3)本发明所构建的筛查指标不受年龄、性别等因素的影响，并且适用于癌症的早期筛查。