腺相关病毒突变体及其应用的制作方法

本发明涉及生物领域中的病毒体及其应用，尤其是涉及一种具有低肝脏嗜性、高特异性的腺相关病毒突变体及其应用。

背景技术：

1、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)是一类包裹着线性单链dna基因组的无包膜小病毒，属于微小病毒科(parvoviridae)依赖病毒属(dependovirus)，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。aav基因组为单链dna片段，包含于非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开放阅读框(rep基因、cap基因)和末端反向重复序列(itr)。重组腺相关病毒载体(raav)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，作为基因转移载体在基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，raav被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)，如基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

2、目前在临床试验中已有多种aav载体被广泛使用，其中使用频率最高的是aav2,例如已上市药物luxturna。另外一些更新和更有效的衣壳，如aav8、aav9和aavrh.10正在用于越来越多的试验。虽然可供选择的血清型不少，但每种血清型均存在一定的缺陷，尤其是由肝毒性引起的不良反应或者死亡是一个关键点。例如，诺华制药今年8月报告了两名儿童患者在接受用于治疗脊髓性肌肉萎缩症(sma)的zolgensma基因疗法后因急性肝衰竭而死亡。虽然这是这款“神药”首次出现这种事故，但监管机构曾警告，zolgensma可能导致严重和潜在的致命肝脏并发症。同年2月，homology medicines宣布fda已暂停hmi-102治疗苯丙酮尿症(pku)成人患者的临床试验，暂停原因是一名受试者肝功能检查结果异常。同样的还有安斯泰来的基因疗法at132，该药物用于治疗x连锁肌小管性肌病，使用aav8载体递送肌管蛋白基因至骨骼肌，从而增加组织中肌管蛋白的表达。该试验被多次暂停，原因之一即是摆脱不掉的严重肝毒性副反应。

3、aav2是人类发现最早、研究最早的血清型之一，在这几十年的研究中aav2也是研究得最清楚的血清型。相较于aav2,aav9在体内更为高效，在多种组织中均能有效感染。但aav9缺点之一是其特异性差，可以同时靶向多种组织器官，特别是肝脏，例如上述药物zolgensma就是基于aav9为载体的。

4、综合上述，虽然aav是当前最安全的基因治疗载体之一，已广泛应用于基因治疗领域，但受阻于特异性问题，特别是肝毒性的影响，很多aav临床用药被迫中断甚至导致用药者死亡。因此开发出一款肝嗜性低，特异性好的aav，或者基于该款aav“骨架”为基础加入特异性靶向肽，从而到达更加特异、低毒和高效的目的，将具有巨大的临床价值和商业应用场景。

技术实现思路

1、在一方面，本文提供了腺相关病毒2(aav2)衣壳蛋白突变体，其在iv可变区包括氨基酸序列ktingsgqnqqtlk(seq id no:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列；在v可变区包括氨基酸序列ttvtq(seq id no:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列。

2、在一些实施方案中，所述iv可变区的12-16个连续氨基酸被氨基酸序列ktingsgqnqqtlk(seq id no:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在v可变区的4-6个连续氨基酸被氨基酸序列ttvtq(seq id no:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。

3、在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第447-461位氨基酸被氨基酸序列ktingsgqnqqtlk(seq id no:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，第490-494位氨基酸被氨基酸序列ttvtq(seq id no:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1所示野生型vp1蛋白氨基酸序列的位置。

4、在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体在所述iv可变区的氨基酸序列rtntpsgtttqsrlq(seq id no:4)被氨基酸序列ktingsgqnqqtlk(seq id no:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在所述v可变区的氨基酸序列ktsad(seq idno:5)被氨基酸序列ttvtq(seq id no:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。

5、在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585位氨基酸为非碱性氨基酸，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1所示野生型vp1蛋白氨基酸序列的位置。

6、在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585位精氨酸(r)突变为丙氨酸(a)，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1所示野生型vp1蛋白氨基酸序列的位置。

7、在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585-587位氨基酸缺失，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1所示野生型vp1蛋白氨基酸序列的位置。

8、在一些实施方案中，所述的衣壳蛋白突变体为衣壳蛋白vp1、vp2或vp3突变体。

9、在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体，包括seq id no:6-8任一项所示的氨基酸序列或与seq id no:6-8任一项所示的氨基酸序列至少有80％、至少90％、至少95％、或至少98％序列一致性的氨基酸序列。

10、另一方面，本文提供了分离的核酸分子，其编码上述衣壳蛋白突变体。

11、在一些实施方案中，所述核酸分子包括seq id no:10-12任一项所示核苷酸序列。

12、另一方面，本文提供了表达载体，其包括上述核酸分子。

13、另一方面，本文提供了宿主细胞，其包括上述核酸分子或表达载体。

14、另一方面，本文提供了宿主细胞，表达上述衣壳蛋白突变体

15、另一方面，本文提供了腺相关病毒(aav)，其上述衣壳蛋白突变体。

16、另一方面，本文提供了制备重组腺相关病毒(raav)的方法，包括至少将如下组分引入宿主细胞：

17、1)上述核酸分子或表达载体；

18、2)包括目的基因的goi质粒。

19、在一些实施方案中，所述目的基因的表达产物为蛋白或rna。

20、另一方面，本文提供了通过上述方法制备的raav。

21、在一些实施方案中，所述raav与野生型aav2或aav9相比具有更低的肝脏靶向性。

22、在一些实施方案中，所述raav与野生型aav2或aav9相比具有更高的肌肉、心脏、大脑、脊髓、肺、肾或眼靶向性。

23、另一方面，本文提供了药物组合物，其包括上述raav和药学上可接受的载体。

24、另一方面，本文提供了上述核酸分子、表达载体或raav在制备药物中的用途。

25、在一些实施方案中，所述药物用于治疗肌肉、心脏、大脑、脊髓、肺、肾或眼相关疾病。

26、本文提供的腺相关病毒突变体具有低肝脏嗜性、低肝毒性，并且特异性更好。利用本文提供的aav衣壳蛋白突变体构建得到的重组腺相关病毒载体特异性更高，安全性更好，应用范围广。