检测溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌的组合物的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌、肺炎链球菌的组合物。

背景技术：

1、溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)是一种凝固酶阴性葡萄球菌，属于人类皮肤黏膜的正常菌群之一，在机体菌群紊乱的情况下，可引起血液、泌尿生殖道和创伤等部位化脓性感染。溶血葡萄球菌在葡萄球菌中的分离率明显增加，尤其在血流感染中，溶血葡萄球菌是第二大最常从临床病例中分离出来的凝固酶阴性葡萄球菌。溶血性葡萄球菌在医院环境，尤其是医疗器械上具有很强的适应性，成为多重耐药葡萄球菌院内感染的重要因素，近年随着广谱抗菌药物的广泛使用，溶血葡萄球菌耐药性日益严重。病原菌的早期诊断对抗生素的使用具有指导意义。

2、阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)广泛分布于自然界中，是肠杆菌属的一种，在人和动物的粪便、泥土、植物中均可被检出，是肠道正常菌群之一，当机体免疫功能下降时可引起呼吸道、伤口、胆管、泌尿道感染及败血症等，易发于长期住院(特别是在icu)、患严重疾病、长期应用广谱抗生素、进行侵袭性操作、应用放疗或化疗及免疫抵制剂等的患者，在icu的革兰阴性菌感染中，仅次于铜绿假单胞菌，位居第二，已成为近年来医院内感染的重要致病菌之一。荧光光定量pcr技术的敏感、快捷、特异等特点可以更好的满足检测的需求。

3、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)是一种球状的革兰氏阳性菌，持有α溶血性，链球菌属下的一种菌，不同的血清型之间毒力及致病性有差异。肺炎球菌感染会导致急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心囊炎、蜂窝组织炎及脑脓肿等疾病发生。肺炎球菌通常定植在人类的呼吸道，因此慢性支气管炎或呼吸道上皮细胞损伤时，极易出现肺炎球菌感染。而肺炎球菌菌血症可伴随任何局灶肺炎球菌感染的急性阶段出现，继发种植到远处可引起化脓性关节炎、脑膜炎和心内膜炎等一系列疾病。

4、溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌均可引起败血症，因此早期诊断病原体并给予及时有效的抗感染治疗是改善预后的关键，能够大大降低发病率和病死率。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的细菌种类，而且目前细菌培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，且多重混合感染的培养极为困难，这给感染患者及临床医生带来很大困扰。

5、因此本领域迫切需要一种简便、快速、客观的检测上述病原体的方法，从而实现明确病原、及早诊断、合理指导抗生素治疗。

6、中国专利cn112961929a公开了一种在种水平检定环境中葡萄球菌的引物组，所述引物组包括扩增金黄色葡萄球菌的引物f1和r1、扩增沃氏葡萄球菌的引物f2和r2、扩增表皮葡萄球菌的引物f3和r3、扩增人葡萄球菌的引物f4和r4；扩增头状葡萄球菌的引物f5和r5和扩增溶血葡萄球菌的引物f6和r6。该发明提供的引物组能够对环境中的金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌进行特异性的检测和鉴定，特异性好、灵敏度高。但其仅是针对葡萄球菌进行检测。

7、本发明优化了pcr反应条件，建立了多重实时荧光定量rt pcr反应体系，可同时针对溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌进行检测。本发明检测结果具有灵敏快速、特异性高且污染小、易于标准化等优点，在实验室检测中可以得到广泛的应用。

技术实现思路

1、本发明的术语和声明：

2、本发明中，术语“核苷酸序列”是指dna或rna中碱基的排列顺序。

3、本发明中，术语“引物”是指人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条dna模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条dna模板链互补。

4、本发明中，术语“探针”是指是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(dna或rna)。

5、本发明技术方案包括：

6、一方面，本发明提供了一种检测溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌的组合物，所述组合物包含分别检测溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌的引物和探针；

7、所述检测溶血葡萄球菌的引物的核苷酸序列如seq id no:1-2所示；

8、所述检测溶血葡萄球菌的探针的核苷酸序列如seq id no:3所示；

9、所述检测阴沟肠杆菌的引物的核苷酸序列如seq id no:4-5所示；

10、所述检测阴沟肠杆菌的探针的核苷酸序列如seq id no:6所示；

11、所述检测肺炎链球菌的引物的核苷酸序列如seq id no:7-8所示；

12、所述检测肺炎链球菌的探针的核苷酸序列如seq id no:9所示。

13、优选地，所述组合物还包括检测内标的引物和探针，所述检测内标的引物和探针的核苷酸序列如seq id no:10-12所示。

14、具体的，所述探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。

15、进一步具体的，所述探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

16、优选地，所述荧光报告基团选自fam、rox、hex、cy5、vic、tet、joe、cy3、cy7、red610、texas red、red670、ned中的至少一种。

17、优选地，所述淬灭荧光基团选自6-tamra、bhq-1-3与结合分子沟的非荧光淬灭剂中的至少一种。

18、具体的，seq id no:3所示的探针的荧光报告基团为fam；

19、具体的，seq id no:6所示的探针的荧光报告基团为rox；

20、具体的，seq id no:9所示的探针的荧光报告基团为hex；

21、具体的，seq id no:12所示的探针的荧光报告基团为cy5。

22、又一方面，本发明提供了一种检测溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。

23、优选地，所述试剂盒还包括缓冲液、taq酶、mg2+、dntp、内参引物探针组、阳性对照品、阴性对照品中的至少一种。

24、优选地，所述taq酶的浓度为5u/μl；

25、优选地，所述mg2+的浓度为1m。

26、又一方面，本发明提供了一种以非诊断目的检测溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌的方法，所述方法为使用上述的组合物或试剂盒进行检测。

27、又一方面，本发明提供了上述组合物或试剂盒或方法在以非诊断目的检测溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌中的应用。

28、又一方面，本发明提供了上述组合物在制备检测溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌的产品中的应用。

29、优选地，所述产品还包括pcr反应液。

30、进一步优选地，所述pcr反应液包括pcr缓冲液、dna聚合酶。

31、再进一步优选地，所述pcr缓冲液选自tris-hcl，bsa，kcl，triton x-100中的至少一种。

32、优选地，所述产品的使用方法包括以下步骤：

33、(1)采用所述产品对样品基因组进行荧光pcr检测；

34、(2)分析检测数据；

35、(3)得到分析结果。

36、具体的，所述步骤(1)中荧光pcr检测为多重实时荧光定量rt pcr检测。

37、进一步优选地，所述荧光pcr检测的反应程序包括以下步骤：

38、(1)预变性：85-95℃，1-3min，1-2个循环；

39、(2)85-95℃，15-20sec，55-65℃，30-35sec，45-50个循环；

40、再进一步优选地，所述荧光pcr检测的反应程序包括以下步骤：

41、(1)预变性：95℃，1min，1个循环；

42、(2)95℃，15sec，58℃，30sec，45个循环；

43、可选地，上述荧光pcr检测的反应程序还可以包括冷却步骤，所述冷却步骤为25-37℃，10-60sec，1-2个循环。

44、根据本发明的一些实施例，所述pcr检测的检测体系为：

45、

46、根据本发明的一些实施例，所述分析数据的方法为：

47、阴性对照：fam、rox、hex三个通道的曲线均无ct值显示；

48、内对照检测cy5为阳性，且ct≤40。

49、阳性对照：fam、rox、hex三个通道的曲线ct≤36。

50、本发明的有益效果包括：

51、(1)本发明优化了pcr反应条件，建立了多重实时荧光定量rt pcr反应体系，可同时针对溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和肺炎链球菌进行检测。

52、(2)本发明检测结果具有灵敏快速、特异性高且污染小、易于标准化等优点，在实验室检测中可以得到广泛的应用。