O型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用

本发明涉及一种病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用，特别涉及一种o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用，本发明属于医药。

背景技术：

1、口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,fmdv)引起主要经济畜种猪牛羊发病的重大动物疫病，oie将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为重点防范的一类动物传染病。我国采取疫苗免疫与扑杀相结合的策略有效防控口蹄疫疫情。随着我国经济实力的不断增强、国际地位的不断提升，我国制定了逐步净化和根除口蹄疫的目标。要实现此目标，安全、高效、可鉴别诊断的口蹄疫新型疫苗是不可或缺的重要技术手段，虽然采用基因操作手段可获得标记口蹄疫灭活疫苗，但是整个研究和生产过程中仍然需要动用活病毒，需要高级别的生产设施，生物安全风险依然存在。

2、为了解决口蹄疫灭活疫苗研发和生产存在生物安全风险、成本高和疫苗成分复杂等关键科学问题。利用反向疫苗学技术，以病原的保护性抗原和/或抗原表位为材料，研发环境友好、生物安全、可鉴别诊断的高效基因工程亚单位疫苗已成为疫苗研究的新方向。但目前大多数基因工程疫苗以保护性抗原为研究对象，通过真核/原核表达系统表达重组蛋白，以获得的重组蛋白多形式，包括重组蛋白混合物，重组融合蛋白等相对简单的形式；也包括表达完整的病毒衣壳蛋白，或分段表达重组蛋白体外组装成vlp。但这些蛋白表达形式存在诸多的缺点和不足，如单基因或多基因联合形式表达的重组蛋白，如不能保证正确的抗原结构，会影响免疫效果。值得一提的是，中国农业科学兰州兽医研究所成功通过分段表达，体外组装获得vlp，并获得了一类新兽药证书。

3、为了研发出生物安全、环境友好、免疫高效的口蹄疫新型基因工程亚单位疫苗，提升表位疫苗免疫功效、并解决大规模生产过程中的关键技术问题，本发明以口蹄疫病毒的保护性抗原表位为元件，利用生物的天然自组装蛋白分子为骨架，设计、研制结构和大小接近天然病原的仿生结构纳米vlp抗原及其疫苗。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

3、本发明利用噬菌体表面展示技术，以o型口蹄疫病毒的保护性抗原表位为元件，以噬菌体ap205为骨架，设计o型口蹄疫病毒的多表位串联dna，并将其与ap205基因融合构建原核重组表达质粒，表达多表位vlp重组蛋白，研制出口蹄疫o型多表位仿生纳米vlp抗原及其疫苗。本发明成功构建原核重组表达质粒，表达、纯化和组装仿生纳米vlp(多表位vlp)，elisa结果显示，重组vlp具有良好的抗原性，其免疫反应性与fmdv灭活抗原没有明显差别，提示该多表位vlp可作为检测抗原替代fmdv灭活抗原，用于o型口蹄疫病毒抗体的检测及其试剂盒的研制。更为重要的是，该重组vlp与isa206 vg佐剂配伍制备的疫苗，免疫动物后能诱导高水平的保护性抗体，加强免疫后抗体水平更高，持续期长，攻毒后100％(5/5)保护。

4、在上述研究的基础上，本发明提出了一种o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原，所述的o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原是选取o型口蹄疫病毒5个拓扑型的代表毒株o/tibet/cha/99，o/mya98/by/2010，o/hn/cha/93、o/xjps/cha/2017和cathay型口蹄疫病毒的保护性抗体的线性抗原表位，依次顺序串联，相邻表位间引入gs间隔子，形成5个毒株的表位串联结构：o/tibet/cha/99-o/mya98-o/hn/cha/93-o/xjps/cha/2017-cathay，命名为ob5；然后将o/tibet/cha/99，o/mya98/by/2010，o/hn/cha/93、o/xjps/cha/2017的抗原表位依次顺序串联，形成4毒株的表位串联结构：o/tibet/cha/99-o/mya98-o/hn/cha/93-o/xjps/cha/2017，命名为ob4；最后将上述设计的ob5多表位串联基因，利用间隔子序列ggggs与spycather和噬菌体ap205基因的依次串联后，再通过ggsggsggs间隔子序列与ob4串联，形成ob5-spycather-ap205-ob4重组抗原蛋白，该重组蛋白自组装成病毒样颗粒抗原。

5、其中，优选的，ob5的氨基酸序列如seq id no.2所示，ob4的氨基酸序列如seq idno.4所示。

6、其中，优选的，所述的病毒样颗粒抗原的氨基酸序列如seq id no.6所示。

7、编码所述的o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原的核酸也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的核酸的核苷酸序列如seq id no.5所示。

8、进一步的，本发明还提出了一种制备所述的o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原的方法，包括以下步骤：

9、(1)口蹄疫病毒o型多表位嵌合dna设计：

10、选取o型口蹄疫病毒5个拓扑型的代表毒株o/tibet/cha/99，o/mya98/by/2010，o/hn/cha/93、o/xjps/cha/2017和cathay型口蹄疫病毒的保护性抗体的线性抗原表位，依次顺序串联，相邻表位间引入gs间隔子，形成5个毒株的表位串联结构：o/tibet/cha/99-o/mya98-o/hn/cha/93-o/xjps/cha/2017-cathay，命名为ob5，其核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；然后将o/tibet/cha/99，o/mya98/by/2010，o/hn/cha/93、o/xjps/cha/2017的抗原表位依次顺序串联，形成4毒株的表位串联结构：o/tibet/cha/99-o/mya98-o/hn/cha/93-o/xjps/cha/2017，命名为ob4，其核苷酸序列如seqid no.3所示，编码的氨基酸序列如seq id no.4所示；

11、(2)ob5-spycather-ap205-ob4嵌合基因重组表达质粒的构建

12、将上述设计的ob5多表位串联基因，利用间隔子序列ggggs与spycather和噬菌体ap205基因的依次串联后，再通过ggsggsggs间隔子序列与ob4串联，形成ob5-spycather-ap205-ob4嵌合基因dna，利用生物软件对嵌合dna进行密码子偏好性优化，并在嵌合dna的5′-和3′-端分别引入nco 1和xho 1特异性酶切位点，且在两个酶切位点与嵌合基因之间引入gs间隔子，整个嵌合基因命名为ob5s25ob4；用bamh 1和xho l分别酶切ob5s25ob4后，将其纯化并插入用相同酶线性化的pet-28a(+)表达质粒的dna片段，用t4连接酶连接两个目的dna片段，构建o型口蹄疫多表位基因原核重组表达质粒，命名为pet-28/ob5s25ob4，通过抗性筛选、双酶切和序列分析鉴定阳性重组表达质粒；

13、(3)重组蛋白表达，纯化

14、采用热激发将阳性重组表达质粒转化bl21(de3)plyss，挑选单菌落接种适量含卡那霉素的lb培养液，37℃、220rmp过夜培养；取过夜培养物，按1％(v/v)加入新制备的无菌含卡那霉素的lb培养液中，37℃、220rmp培养，当od600≈0.4-0.6时，加入0.5mm的iptg继续培养4～6小时后，4000rpm离心20min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，超声破碎，20000g离心20min收集上清，弃沉淀；按照ni-nta组氨酸纯化柱说明书纯化蛋白，即为o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原，命名为ob5s25ob4。

15、其中，优选的，所述的o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原的氨基酸序列如seqid no.6所示。

16、再进一步的，本发明还提出了所述的o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原在制备预防o型口蹄疫疫苗中的用途。

17、更进一步的，本发明还提出了一种o型口蹄疫多表位病毒样颗粒疫苗，所述的疫苗中含有所述的o型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原以及佐剂。

18、其中，优选的，所述的佐剂为isa206 vg。

19、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

20、本发明利用e.coli系统成功表达了o型口蹄疫病毒多表位重组蛋白，该蛋白能够自组装vlp形式。免疫学试验结果显示，该vlp抗原具有良好的抗原性，其与o型口蹄疫病毒的抗原反应性没有明显的差异，可作为检测抗原替代口蹄疫病毒灭活抗原建立检测方法。利用该vlp抗原制成的疫苗不仅能诱导产生高水平的保护性抗体，而且能保护免疫动物抵抗病毒攻击。更为重要的是，该疫苗不受动物种属限制，对猪牛羊o型口蹄疫均有免疫保护作用，是一种具有广阔前景的新型疫苗，将产生巨大经济效益和社会效益。