基于ddPCR法检测HIV病毒的引物组、探针组、试剂盒及用途的制作方法

基于ddpcr法检测hiv病毒的引物组、探针组、试剂盒及用途
技术领域
1.本发明涉及分子诊断技术领域，特别是涉及到一种基于ddpcr法检测hiv病毒的引物组、探针组、试剂盒及用途。


背景技术：

2.自1981年首次报道hiv病例以来，全球hiv患者日渐增多，已被我国列为乙类传染病。目前还没有针对hiv病毒的特效药或疫苗，因此预防和控制艾滋病病情显得尤为重要。目前实验室诊断hiv病毒的方法主要为免疫学抗原抗体检测和核酸检测两种。相较免疫学方法，核酸检测可在血清变化之前检测到hiv感染，且实验更加便捷。微流控ddpcr法是现今新型定量技术，通过将核酸反应液分散至芯片各微反应器中，经过pcr循环后，检测每个微反应器中的荧光信号，由数据分析终端计算目标浓度，称为绝对定量。较传统pcr，无需准备标准品，且具有更高的特异性和抗抑制能力。由于hiv病毒变异度非常高，给引物设计环节造成巨大的困难，单一位点引物检测易出现漏捡的情况。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种基于ddpcr法检测hiv病毒的引物组、探针组、试剂盒及用途，以克服现有技术中的不足。
4.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
5.本发明实施例提供了一种基于ddpcr法检测hiv病毒的引物组，其包括：
6.检测gapdh基因的第一引物对，包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如seq id no.1所示，所述第二引物的序列如seq id no.2所示；
7.检测pol基因的第二引物对，包括第三引物和第四引物，且所述第三引物的序列如seq id no.3所示，所述第四引物的序列如seq id no.4所示；
8.检测ltr基因的第三引物对，包括第五引物和第六引物，且所述第五引物的序列如seq id no.5所示，所述第六引物的序列如seq id no.6所示；
9.检测gag基因的第四引物对，包括第七引物和第八引物，且所述第七引物的序列如seq id no.7所示，所述第八引物的序列如seq id no.8所示。
10.本发明实施例还提供了一种基于ddpcr法检测hiv病毒的探针组，其包括：
11.检测gapdh基因的第一探针，其序列如seq id no.9所示；
12.检测pol基因的第二探针，其序列如seq id no.10所示；
13.检测ltr基因的第三探针，其序列如seq id no.11所示；
14.检测gag基因的第四探针，其序列如seq id no.12所示。
15.本发明实施例还提供了一种基于ddpcr法检测hiv病毒的试剂盒，其包括：hiv扩增反应液、酶混合液及引物探针反应液；其中，所述引物探针反应液包括前述的引物组及探针组。
16.本发明实施例还提供了前述的试剂盒于制备基于ddpcr法检测hiv病毒的产品中
的用途。
17.本发明实施例还提供了一种包含前述的试剂盒的产品，所述产品应用于基于ddpcr法检测hiv病毒的方法，所述方法包括：
18.提供待检测样本；
19.将所述待检测样本与所述试剂盒混合形成混合液；将所述混合液形成微液滴，之后采用数字pcr检测技术，对所述微液滴进行pcr扩增；
20.以及，对pcr扩增产物进行定量检测分析。
21.与现有技术相比，本发明的优点包括：本发明提供的基于ddpcr法检测hiv病毒的试剂盒与目前的同类型产品相比，其优点如下：
22.(1)多重反应，一个反应中实现四重检测，同时检测hiv病毒基因(pol基因、ltr基因和gag基因)和人内参基因(gapdh基因)，人内参基因的检测可实时监测样本中出现的异常，同时检测hiv病毒三个基因可在很大程度上避免其中某一基因发生突变而导致假阴性的情况；
23.(2)一个反应中实现四重检测，大大增加了检测通量，节约检测成本；
24.(3)一步法rt-pcr反应，避免反复开盖造成的污染，减少实验步骤，缩短实验时间；
25.(4)ddpcr法相较传统qpcr法具有更高的特异性和抗抑制能力等特点，且无需制备标准品即可进行核酸定量。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1是本发明实施例1中多重rt-qpcr一步法检测hiv假病毒结果图；
28.图2是本发明实施例2中gag基因每个浓度梯度ddpcr检测微滴数和理论投入量构建标准曲线图；
29.图3是本发明实施例2中gapdh基因每个浓度梯度ddpcr检测微滴数和理论投入量构建标准曲线图；
30.图4是本发明实施例2中ltr基因每个浓度梯度ddpcr检测微滴数和理论投入量构建标准曲线图；
31.图5是本发明实施例2中pol基因每个浓度梯度ddpcr检测微滴数和理论投入量构建标准曲线图；
32.图6是本发明实施例2中gag基因微滴分布图；
33.图7是本发明实施例2中gapdh基因微滴分布图；
34.图8是本发明实施例2中ltr基因微滴分布图；
35.图9是本发明实施例2中pol基因微滴分布图。
具体实施方式
36.鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技
术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.本发明实施例的一个方面提供了一种基于ddpcr法检测hiv病毒的引物组包括：
38.检测gapdh基因的第一引物对，包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如seq id no.1所示(gpdh基因上游引物，具体序列为5
’‑
caggtcaactttggtatcgtgac-3’)，所述第二引物的序列如seq id no.2所示(gpdh基因下游引物，具体序列为5
’‑
ccactagaggcagggattgtga-3’)；
39.检测pol基因的第二引物对，包括第三引物和第四引物，且所述第三引物的序列如seq id no.3所示(pol基因上游引物，具体序列为5
’‑
gaatgatatgcaacacatacatgagc-3’)，所述第四引物的序列如seq id no.4所示(pol基因下游引物，具体序列为5
’‑
actcgaccttcaccatgatcc-3’)；
40.检测ltr基因的第三引物对，包括第五引物和第六引物，且所述第五引物的序列如seq id no.5所示(ltr基因上游引物，具体序列为5
’‑
cagtatcctgcttgccgta-3’)，所述第六引物的序列如seq id no.6所示(ltr基因下游引物，具体序列为5
’‑
ggttagctatgctactgctt-3’)；
41.检测gag基因的第四引物对，包括第七引物和第八引物，且所述第七引物的序列如seq id no.7所示(gag基因上游引物，具体序列为5
’‑
agcccagaagtaatacccatgtt-3’)，所述第八引物的序列如seq id no.8所示(gag基因下游引物，具体序列为5
’‑
cattctagcagcttcctcaagtt-3’)。
42.本发明实施例的另一个方面还提供了一种基于ddpcr法检测hiv病毒的探针组，其包括：
43.检测gapdh基因的第一探针，其序列如seq id no.9所示(具体序列为5
’‑
vic-ctacgcagtatgatcactgccatcg-3’)；
44.检测pol基因的第二探针，其序列如seq id no.10所示(具体序列为5
’‑
fam-tctcttgtccctgtaataaacccg-bhq1-3’)；
45.检测ltr基因的第三探针，其序列如seq id no.11所示(具体序列为5
’‑
rox-aatcatggactagagtccctgccc-bhq2-3’)；
46.检测gag基因的第四探针，其序列如seq id no.12所示(具体序列为5
’‑
cy5-catatcgaggatgacccttgacg-bhq3-3’)。
47.进一步地，所述第一探针还包括荧光标记基团vic。
48.进一步地，所述第二探针还包括荧光标记基团fam。
49.进一步地，所述第三探针还包括荧光标记基团rox。
50.进一步地，所述第四探针还包括荧光标记基团cy5。
51.本发明实施例的另一个方面还提供了一种基于ddpcr法检测hiv病毒的试剂盒，其包括：hiv扩增反应液、酶混合液及引物探针反应液；其中，所述引物探针反应液包括前述的引物组及探针组。
52.进一步地，所述试剂盒还包括荧光标记基团vic、fam、rox和cy5。
53.进一步地，所述hiv扩增反应液由rt-qpcr buffer、dntp混合而成。
54.进一步地，所述酶混合液由逆转录酶、热启动fast taq酶和热敏型udg酶组成。
55.进一步地，所述引物探针反应液中第一引物、第二引物、第一探针的浓度均为0.5～3μmol/l，第三引物、第四引物、第二探针的浓度均为1～4μmol/l，第五引物、第六引物、第三探针的浓度均为1～4μmol/l，第七引物、第八引物、第四探针的浓度均为1～4μmol/l。
56.在一些更为具体的实施方案中，所述基于ddpcr法检测hiv病毒的试剂盒包括hiv扩增反应液、酶混合液、引物探针反应液。
57.进一步地，所述hiv扩增反应液由rt-qpcr buffer、dntp混合而成：
58.rt-qpcr buffer包含50-150mm的tris-hcl(ph8.5)，100-300mm的氯化钾，5-20mm的氯化镁，0.05％-0.5％tween20，0.05％-0.5％np-40，0.5-2.5mg/ml牛血清白蛋白。为一步法rt-qpcr反应提供所需要的金属离子，以及缓冲体系和其他辅助条件；
59.dntp由5-10mm的datp、5-10mm的dctp、5-10mm的dgtp、4-8mm的dttp、0.5-2mm的dutp混合而成，为一步法rt-qpcr反应提供延伸所需要的碱基。
60.进一步地，所述酶混合液：酶混合液由逆转录、热启动fast taq酶和热敏型udg酶组成。突变改造的逆转录酶，具有更高效的延伸性和反应效率，同时支持高温反应(55℃)，提高目的基因逆转录的特异性。使用特殊修饰的热启动fast taq酶具有激活时间短、延伸速度快的特点，大大缩短检测时间。热敏型udg酶，在室温(25℃)时即能够降解含尿嘧啶(du)的扩增产物，能有效防止扩增产物污染。酶混合液中逆转录酶浓度为40u/μl，热启动fast taq酶浓度为0.5u/μl，udg酶浓度为0.5u/μl。
61.进一步地，所述引物探针反应液由hiv病毒基因引物探针(pol基因、ltr基因和gag基因)和人内参基因引物探针(gapdh基因)组成。
62.引物探针序列如下：
63.1)gapdh基因：vic荧光
64.上游引物：5
’‑
caggtcaactttggtatcgtgac-3’65.下游引物：5
’‑
ccactagaggcagggattgtga-3’66.荧光探针：5
’‑
vic-ctacgcagtatgatcactgccatcg-3’67.2)pol基因：fam荧光
68.上游引物：5
’‑
gaatgatatgcaacacatacatgagc-3’69.下游引物：5
’‑
actcgaccttcaccatgatcc-3’70.荧光探针：5
’‑
fam-tctcttgtccctgtaataaacccg-bhq1-3’71.3)ltr基因：rox荧光
72.上游引物：5
’‑
cagtatcctgcttgccgta-3’73.下游引物：5
’‑
ggttagctatgctactgctt-3’74.荧光探针：5
’‑
rox-aatcatggactagagtccctgccc-bhq2-3’75.4)gag基因：cy5荧光
76.上游引物：5
’‑
agcccagaagtaatacccatgtt-3’77.下游引物：5
’‑
cattctagcagcttcctcaagtt-3’78.荧光探针：5
’‑
cy5-catatcgaggatgacccttgacg-bhq3-3’79.引物探针反应液中gapdh引物探针浓度为0.5～3μm，pol基因引物探针浓度为1～4μm，ltr基因引物探针浓度为1～4μm，gag基因引物探针浓度为1～4μm，所有引物探针均合成
自上海捷瑞生物工程有限公司。
80.具体地，本发明中的扩增反应液及反应扩增程序如表1、表2：
81.表1
82.反应试剂体积(μl)hiv扩增反应液2引物探针反应液2～4酶混合液2～5样本1～10无rnase水补足体积至20μl
83.表2
[0084][0085][0086]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的试剂盒于制备基于ddpcr法检测hiv病毒的产品中的用途。
[0087]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含权利要求前述的试剂盒的产品，所述产品应用于基于ddpcr法检测hiv病毒的方法，所述方法包括：
[0088]
提供待检测样本；
[0089]
将所述待检测样本与所述试剂盒混合形成混合液；将所述混合液形成微液滴，之后采用数字pcr检测技术，对所述微液滴进行pcr扩增；
[0090]
以及，对pcr扩增产物进行定量检测分析。
[0091]
进一步地，所述待检测样本为rna样本。
[0092]
以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0093]
实施例1一步法rt-qpcr验证引物探针扩增效果
[0094]
1、试剂：总rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：dp419)、hiv扩增反应液、酶混合液、引物探针反应液。
[0095]
2、仪器：abi7500。
[0096]
3、样本：人血浆稀释的hiv假病毒
[0097]
4、实验步骤：
[0098]
用人血浆稀释hiv假病毒然后进行核酸提取。具体步骤如下：
[0099]
第一次使用前应在去蛋白液rd、漂洗液rw中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
[0100]
1)样品处理
[0101]
将待提血液转移至15ml离心管中，1600rpm离心10min。
[0102]
将上层血浆转移至2ml离心管中，12,000rpm离心10min，重复上一步骤。
[0103]
将分离所得到的血浆收集到15ml离心管中。取2ml血浆混50μl假病毒(≥10^5copies/μl)振荡混匀后吸取200ul；加入5倍体积rz，充分振荡混匀。
[0104]
2)样品室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
[0105]
3)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。
[0106]
4)4℃12,000rpm离心10min，样品会分成三层：上清水相层、中间蛋白层、下层黄色的有机相，rna主要在上清水相中，吸取上层水相500μl加入新的离心管中。
[0107]
5)缓慢加入500μl无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中，4℃10,000rpm离心30s，按照上述步骤将溶液和混合物全部加入吸附柱cr3中弃掉收集管中的废液。
[0108]
6)向吸附柱cr3中加入500μl加入无水乙醇的去蛋白液rd，4℃，10,000rpm离心30s，弃废液，将cr3放入收集管中。
[0109]
7)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，4℃10,000rpm离心30s，弃废液。
[0110]
8)重复操作步骤8
[0111]
9)将吸附柱放入2ml收集管中，4℃12,000rpm离心2min，去除残余液体。
[0112]
10)将吸附柱cr3转入一个新的1.5ml离心管中，加90μl rnase free ddh2o，室温放置2min，4℃12000rpm离心2min。离心管底部即为需要的rna溶液，-70℃保存备用。
[0113]
11)rt-qpcr法反应体系配制：
[0114]
引物mix配置：
[0115]
gapdh引物探针浓度为3μm，pol基因引物探针浓度为4μm，ltr基因引物探针浓度为4μm，gag基因引物探针浓度为4μm
[0116]
使用qpcr法验证引物扩增效果，反应体系和反应程序见表3、表4，扩增结果见附图1。
[0117]
表3
[0118]
反应试剂体积(μl)hiv扩增反应液2引物探针反应液4酶混合液2样本10无rnase水2
[0119]
表4
[0120]
[0121][0122]
5、实验结果见图1：
[0123]
图1：多重rt-qpcr一步法检测hiv假病毒结果。
[0124]
6、实验结论：
[0125]
hiv病毒基因(pol基因、ltr基因和gag基因)和人内参基因(gapdh基因)均呈现典型s型曲线扩增，说明扩增结果较好。
[0126]
实施例2：ddpcr法定量扩增验证引物探针扩增效果
[0127]
1、试剂：总rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：dp419)、hiv扩增反应液、酶混合液、引物探针反应液。
[0128]
2、仪器：qiacuity数字pcr仪。
[0129]
3、样本：人血浆稀释的不同浓度梯度的hiv假病毒。
[0130]
4、实验步骤：
[0131]
1)取2ml血浆混50μl假病毒(≥10^5copies/μl)混匀离心后吸取200μl进行总rna提取，为第三组样本；
[0132]
吸取200μl第三组样本加入200μl血浆混匀离心后吸取200μl进行总rna提取，为第四组样本；
[0133]
吸取200μl第三组样本加入400μl血浆混匀离心后吸取200μl进行总rna提取，为第五组样本；
[0134]
吸取200μl第三组样本加入600μl血浆混匀离心后吸取200μl进行总rna提取，为第六组样本；
[0135]
吸取200μl第三组样本加入800μl血浆混匀离心后吸取200μl进行总rna提取，为第七组样本。
[0136]
总rna提取方法见实施例1。
[0137]
2)ddpcr上机测试：
[0138]
引物mix配置：
[0139]
gapdh引物探针浓度为3μm，pol基因引物探针浓度为3μm，ltr基因引物探针浓度为2μm，gag基因引物探针浓度为2μm。
[0140]
反应体系和扩增程序见表5-7。
[0141]
表5
[0142]
反应试剂体积(μl)hiv扩增反应液2引物探针反应液4酶混合液2
样本8无rnase水4
[0143]
表6
[0144][0145]
5、实验结果：
[0146]
1)数字pcr检测数据见表7：
[0147]
第一组：gapdh延误探针扩增阴性对照结果；
[0148]
第二组：引物探针反应液扩增阴性对照结果；
[0149]
第三组样本：反应体系中hiv假病毒拷贝数为4.5e+04copies；
[0150]
第四组样本：反应体系中hiv假病毒拷贝数为2.3e+04copies；
[0151]
第五组样本：反应体系中hiv假病毒拷贝数为1.5e+04copies；
[0152]
第六组样本：反应体系中hiv假病毒拷贝数为1.1e+04copies；
[0153]
第七组样本：反应体系中hiv假病毒拷贝数为9.0e+03copies。
[0154]
表7
[0155][0156]
2)根据表5中每个基因每个浓度梯度ddpcr检测微滴数和理论投入量构建标准曲线，结果见图2-5：
[0157]
3)各通道基因微滴扩增1d图见图6～9：
[0158]
图6：gag基因微滴分布图；
[0159]
图7：gapdh基因微滴分布图；
[0160]
图8：ltr基因微滴分布图；
[0161]
图9：pol基因微滴分布图；
[0162]
6、实验结论：
[0163]
1)两组阴性对照扩增所有基因皆没有阳性液滴，表明反应体系没有污染，扩增正常。
[0164]
2)第三组模板(4.5e+04copies)因投入量过高，ltr基因的所有微滴均为阳性微滴，数据不符合泊松分布，数据不参与标准曲线构建。
[0165]
3)根据标准曲线分析，所有基因标准曲线r2均大于0.98，说明浓度梯度稀释样本的线性较好，整体扩增效率符合要求，hiv假病毒不同梯度投入量与ddpcr检测数据比例相符。
[0166]
本实施例实验结果表明，采用ddpcr的方法使用多重引物探针能够对hiv病毒进行很好的检测。
[0167]
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
[0168]
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
[0169]
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
[0170]
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
[0171]
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。