一种液滴式数字PCR芯片的制作方法

本发明属于核酸检测芯片领域，具体地说，涉及一种液滴式数字pcr芯片。

背景技术：

1、由于不依赖标准曲线定量，不受pcr扩增效率影响，同时具有更高灵敏度和准确度，液滴式数字pcr技术逐渐成为一种在癌症精准筛查、病原微生物检测和传染病筛查等临床医学辅助诊断领域发挥重要作用的检测技术手段。众所周知，通过增加液滴，可以提高液滴式数字pcr的检测精度和降低液滴式数字pcr的检测限。但是由于目前这些液滴式数字pcr检测流程中不包括核酸纯化的样品处理功能。换句话说，在液滴式数字pcr检测时，需要核酸检测人员先将样本在芯片外进行处理，然后再转移到额外的液滴生成芯片中以获得微液滴来进行数字pcr检测。但是，样本转移过程中存在不可避免的样品损失和样品污染的问题极大影响了液滴式数字pcr的应用。

2、因此，非常有必要开发能实现“样品进，结果出”的液滴式数字pcr芯片，以提高液滴式数字pcr检测的集成化和自动化程度，同时降低核酸泄漏污染环境和影响检测人员身体健康的风险。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于克服液滴式数字pcr芯片现有技术的不足，提供一种可以克服上述问题或者部分地解决上述问题的集核酸样品裂解、洗涤、洗脱、pcr反应液混合、液滴生成、数字pcr 检测全流程于一体的液滴式数字 pcr芯片，为广大pcr实验室高效精准地数字pcr检测服务的实施提供有力保障。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

3、一种液滴式数字pcr芯片，所述芯片由基板和盖板构成，所述基板包括有核酸样品的裂解腔、洗涤腔、洗脱腔、pcr反应液混合腔（简称为：混合腔）、液滴腔和数字pcr检测腔（简称为：检测腔），能够在单一芯片上完成对核酸样品的处理、液滴生成和检测的工作，提高液滴式数字pcr检测的集成化和自动化程度，同时降低核酸泄漏污染环境和影响检测人员身体健康的风险。

4、根据本发明的实施例，还可以对本发明作进一步的优化，以下为优化后形成的技术方案：

5、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片包括相贴合的基板和盖板。

6、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的基板和盖板通过热压键合封装制成。

7、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的基板和盖板通过等离子键合封装制成。

8、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的盖板由pmma和氮化硅的混合材料制成，所述混合材料中氮化硅的质量含量为1%-15%。

9、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的盖板由pdms和硼化锆的混合材料制成，所述混合材料中硼化锆的质量含量为0.5%-10%。

10、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的基板由二氧化硅和pdms的混合材料制成，所述混合材料中pdms的质量含量为5%-25%。

11、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的基板由氮化硼和pdms的混合材料制成，所述混合材料中pdms的质量含量为20%-40%。

12、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的基板设置有裂解腔、洗涤腔、洗脱腔、混合腔、液滴腔和检测腔。

13、在本发明的一些实施方式中，一种液滴式pcr数字芯片，与所述芯片的基板不贴合的盖板的一面标有裂解腔、洗涤腔、洗脱腔、混合腔、液滴腔和检测腔的字样。

14、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的基板分别设置有裂解腔、洗涤腔、洗脱腔、混合腔、液滴腔和检测腔的注入管路。

15、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片的基板设置有安全管路。

16、在其中一个优选的实施例中，所述芯片基板的裂解腔与所述基板的洗涤腔之间设置有微流控孔道；所述微流控孔道设置有止逆阀。

17、在其中一个优选的实施例中，所述芯片基板的洗涤腔与所述基板的洗脱腔之间设置有微流控孔道；所述微流控孔道设置有止逆阀。

18、在其中一个优选的实施例中，所述芯片基板的洗脱腔与所述基板的混合腔之间设置有微流控孔道；所述微流控孔道设置有止逆阀。

19、在其中一个优选的实施例中，所述芯片基板的混合腔与所述基板的液滴腔之间设置有微流控孔道；所述微流控孔道设置有止逆阀和具有过滤磁珠和止逆功能的雾化喷嘴。

20、在其中一个优选的实施例中，所述芯片基板的液滴腔与所述芯片基板的检测腔之间设置有液滴平铺孔道；所述液滴平铺孔道设置有止逆阀；所述液滴平铺孔道为沙漏形状设计。

21、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径一致或不一致。

22、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为0.5毫米-1.5毫米。在一个实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为0.51毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为0.52毫米，0.53毫米，0.54毫米，0.55毫米，0.56毫米，0.57毫米，0.58毫米，0.59毫米，0.6毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为0.61毫米-0.7毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为0.71毫米-0.8毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为0.81毫米-0.9毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为0.91毫米-1毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为1.1毫米-1.2毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为1.21毫米-1.3毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为1.31毫米-1.4毫米。在某些实施方式中，其中所述连接不同腔的注入管路和安全管路的管径为1.41毫米-1.5毫米。

23、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片基板设置有的裂解腔、洗涤腔、洗脱腔、混合腔、液滴腔和检测腔之间分别相互连接的微流控通道截面积为所述裂解腔样品进样管路通道截面积的1/4-2/3。在一个实施方式中，其中所述微流控通道截面积为所述裂解腔注入管路通道截面积的1/3。在某些实施方式中，其中所述微流控通道截面积为所述裂解腔注入管路通道截面积的1/3和1/2。

24、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述检测腔的体积为0.1微升-200微升。在一个实施方式中，其中所述单个检测腔的体积为0.2微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积分别为0.3微升，0.4微升，0.5微升，0.6微升，0.7微升，0.8微升，0.9微升，1.0微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为1.1-5微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为5.1-10微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为10.1-15微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为15.1-20微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为20.1-25微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为25.1-50微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为50.1-100微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为100.1-150微升。在某些实施方式中，其中单个检测腔的体积为150.1-199.9微升。

25、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述通过雾化喷嘴形成的微液滴直径为0.05-50μm。

26、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述液滴平铺通道的高度为微液滴直径的的1-2倍。

27、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述检测腔的高度为微液滴直径的1.02-1.25倍。在一个实施方式中，其中检测腔的高度为微液滴直径的1.1倍。在某些实施方式中，其中检测腔的高度为微液滴直径的1.2倍。

28、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述检测腔的数量为1-16个。在一个实施方式中，其中所述检测腔的数量为2个。在某些实施方式中，其中所述检测腔的数量分别为3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个。

29、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述芯片基板和盖板键合形成二层结构。

30、在其中一个优选的实施例中，一种液滴式pcr数字芯片，所述盖板的厚度为0.1-0.5毫米。在一个实施方式中，其中所述盖板的厚度为0.11毫米。在某些实施方式中，其中所述盖板的厚度分别为0.12毫米，0.13毫米，0.14毫米，0.15毫米，0.16毫米，0.17毫米，0.18毫米，0.19毫米，0.2毫米。在某些实施方式中，其中所述盖板的厚度为0.21毫米-0.3毫米。在某些实施方式中，其中所述盖板的厚度为0.31毫米-0.4毫米。在某些实施方式中，其中所述盖板的厚度为0.41毫米-0.5毫米。

31、一种液滴式数字pcr芯片的制备方法，包括如下步骤：

32、第一步，采用光刻技术制作硅片模具，刻蚀出裂解腔、洗涤腔、洗脱腔、混合腔、液滴腔和检测腔的边缘线及依次连通各腔的微流控孔道；第二步，在硅片模具上浇铸，倒模后形成芯片基板，在裂解腔、洗涤腔、洗脱腔、混合腔、液滴腔和检测腔打通孔道，并功能化；第三步，采用键合封装技术，将功能化的芯片基板与没有标有裂解腔、洗涤腔、洗脱腔、混合腔、液滴腔和检测腔字样的盖板一面键合，完成芯片制作。

33、一种液滴式数字pcr芯片的使用方法，包括如下步骤：

34、步骤一：分别依次打开芯片裂解腔、洗涤腔、洗脱腔和混合腔的注入口防护塞，通过移液器进油，让裂解腔、洗涤腔、洗脱腔和混合腔中的油相高度均为腔体高度的一半，然后复位各个注入口防护塞；步骤二：打开裂解腔的注入口防护塞，通过移液器依次加入裂解液，蛋白酶k和磁珠，然后复位注入口防护塞；步骤三：打开洗涤腔的注入口防护塞，通过移液器依次加入乙醇水溶液，然后复位试剂注入口防护塞；步骤四：打开洗脱腔的注入口防护塞，通过移液器分别依次加入peg和氯化镁溶液；步骤五：打开混合腔的注入口防护塞，通过移液器分别依次pcr反应液的引物，酶，水，然后复位注入口防护塞；步骤六：打开芯片裂解腔的注入口防护塞，通过移液器加入样品，然后复位注入口防护塞；步骤七：将芯片在磁力架上放置一段时间，让裂解腔中各组分充分混匀，随后把芯片在恒温箱中放置一段时间，促使样本中核酸分子与磁珠充分结合；步骤八：打开裂解腔和洗涤腔之间的微流控通道阀门，让裂解腔中的磁珠借助磁力架进入洗涤腔，复位微流控通道阀门，充分混匀磁珠和洗涤液；步骤九：打开洗涤腔和洗脱腔之间的微流控通道阀门，让洗涤腔中的磁珠进入洗脱腔，复位微流控通道阀门，充分混匀磁珠和洗脱液；步骤十：打开洗脱腔和混合腔之间的微流控通道阀门，让洗脱腔中的磁珠进入混合腔，复位微流控通道阀门，充分混匀，静置一段时间，让核酸和磁珠脱离；步骤十一：打开混合腔和液滴腔之间的微流控通道阀门，让混合腔中的pcr反应液流经具有磁珠过滤功能的雾化喷嘴，把磁珠留在洗脱腔，复位微流控通道阀门；与磁珠分离的混合液流经具有止逆功能的雾化喷嘴孔边际时展开成液体层，因为空气动力的不稳定，将液体层断裂变成拉长了的管孔状的粗细的圆柱体，然后变成液滴。液体经过内部压力，将内部的液体挤压进喷嘴中，雾化喷嘴内部放置有一块石英叶片，高速活动的液体经过石英叶片的旋流腔冲击反弹后构成大小均一的独立的微液滴；步骤十二：打开液滴腔与检测腔的微液滴平铺孔道阀门，使微液滴沿平铺孔道进入和平铺于检测腔，复位微液滴平铺孔道阀门，将芯片放置于pcr仪中进行热循环，扩增完成后，转移到荧光显微镜下对微液滴依次成像，并通过软件统计阳性(有荧光)与阴性(无荧光)微液滴比例，根据数字pcr计算公式得出样品核酸浓度，给出检测结果。同样的，此芯片能够按照与上述类似的工作方式，应用于蛋白质样品的处理并实现数字酶联免疫吸附(elisa)检测。如果发生安全故障问题，可以打开安全出口塞子和安全阀门，通过安全出口和安全管路进行安全故障排除，以保证操作安全。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

36、（1）液滴式数字pcr芯片生产时仅需键合一次，使用过程无须形成真空或负压环境；

37、（2）液滴式数字pcr芯片融合了核酸样品裂解，洗涤、核酸与pcr反应液混合、液滴生成和pcr反应检测的功能，实现核酸分析“样品进，结果出”的的全部流程；

38、（3）液滴式数字pcr芯片借助各个不同腔的递降式设计和各个腔之间具有止逆功能的微流控通道阀门实现了多个串联的不同腔的不同功能，且各腔之间液体能充分隔绝，无交叉污染；此外，雾化喷嘴生成微液滴的过程稳定，并能够通过微液滴平铺孔道让微液滴独立地稳定平铺于检测腔，有利于提高检测准确度；

39、（4）液滴式数字pcr芯片的样品在芯片上以油中的液滴形式存在，避免了核酸分子以气溶胶形式污染检测环境；且由于油的隔离作用，核酸样品全程与芯片结构不直接接触，避免了核酸分子吸附在不同芯片腔室表面或通道表面导致损失或残留的情况，使得芯片可以通过适当的设计实现反复重复使用。