工程化抗体和包含工程化抗体的抗体-药物偶联物的制作方法

本发明主要涉及生物制药领域，尤其工程化抗体和抗体-药物偶联物。

背景技术：

1、抗体是多功能的免疫球蛋白，具有对靶抗原独特的结合特异性以及一系列非抗原依赖性免疫相互作用，由此在免疫系统中发挥着重要作用。当前使用的许多治疗用生物药、诊断试剂和研究试剂是针对感兴趣的病理、免疫机制或生物学机制相关抗原的抗体。

2、近年来，人们为开发带有药物载荷的抗体偶联物做出了大量的努力。就抗体药物偶联物(adc)而言，adc包含用于靶向的抗体，用于药物附接的连接子和作为效应物的强效的药物载荷。抗体或其相关形式通过抗体-抗原相互作用将细胞毒性药物带向表达抗原的细胞或其他靶细胞。同时，药物与抗体偶联后毒性显著下降。因此，adc通过降低最小有效剂量(med)和提高最大耐受剂量(mtd)扩大了治疗窗口。fda批准的adc药物有例如mylotarg、adcetris、kadcyla、besponsa、polivy、padcev、enhertu、trodelvy和blenrep。

3、adc研发成功依赖于抗体的选择、连接子-药物载荷的选择、连接子-药物载荷的偶联方式以及偶联过程的研发。抗体中的半胱氨酸巯基作为强亲核试剂是理想的偶联反应基团。抗体的天然形式中，半胱氨酸残基以二硫键形式存在，因此，抗体轻链与重链之间的二硫键还原为偶联提供了理想的游离半胱氨酸巯基。为了应对优选药物载荷-抗体比(par)和偶联位置的相关机遇与挑战，本领域开发了多种偶联方法。理想情况下，应将适量的药物载荷连接到抗体，由此得到的是异质性的adc产品。低par的偶联产品疗效不足，高par的产品则毒性高且不稳定。所以，adc的异质性阻碍了治疗窗口的扩大。因此，进行了诸如抗体工程之类的努力来提高adc产品的均质性。

4、一种方法采用对抗体进行点突变来引入具有高反应性残基的氨基酸供偶联之用。thiomabtm技术由基因泰克(genentech)公司开发，通过诱导抗体上的半胱氨酸突变(jagathr junutula,等,细胞毒性药物与抗体位点特异性偶联改进治疗指数(site-specificconjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeuticindex),nature biotechnology,2008,26(8):925–932)。与thiomab的偶联发生在还原后的经改造的半胱氨酸残基上，产生了高均质性的偶联产物。非天然氨基酸(nnaa)技术也用于生产均质性的偶联物。例如，用非天然氨基酸在抗体中引入酮基或叠氮基作为偶联位点(jun y.axup,等,使用非天然氨基酸合成位点特异性抗体-药物偶联物(synthesis ofsite-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids),pnas,2012,109(40):16101-16106；michael p.vanbrunt,等,在哺乳动物细胞中遗传编码含有氨基酸的叠氮化物，使用点击环加成化学能够实现位点特异性抗体-药物偶联物(genetically encoded azide containing amino acid in mammalian cells enablessite-specific antibody–drug conjugates using click cycloaddition chemistry),bioconjugate chem.,2015,26(11):2249-2260)，由于特异性反应，也得到了高度均质的产物。

5、基于点突变的方法存在一些缺点。首先，需要仔细选择突变位点，否则抗体的稳定性和结合效率都会受到影响。其次，点突变抗体的表达水平通常很低，这在化学成分生产和控制(cmc)阶段会成为问题。

6、另一种方法是引入可被酶识别的短多肽标签作为偶联位点。谷氨酰胺标签(llqg)作为mtg识别基序(pavel strop等，“位点的重要性：结合位点调节抗体药物偶联物的稳定性和药代动力学(location matters:site of conjugation modulates stability andpharmacokinetics of antibody drug conjugates)”,chemistry&biology,2013,20(2):161-167)，lpetg作为分选酶a识别基序(roger r.beerli等，“分选酶介导形成体外体内高效力的位点特异性抗体药物偶联物(sortase enzyme-mediated generation of site-specifically conjugated antibody drug conjugates with high in vitro and invivo potency)”，plos one,2015,10(7):e0131177)、以及lcxpxr作为甲酰基甘氨酸生成酶(fge)识别基序(peng wu等，“用遗传编码醛标签在哺乳动物细胞中产生的定点化学修饰的重组蛋白(site-specific chemical modification of recombinant proteins producedin mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag)”，pnas,2009,106(9):3000-3005)用于偶联获得了高度均质的产物，其中，药物连接于多肽标签。

7、短多肽标签的缺点与基于点突变的方法相似。需要筛选多肽标签的插入位点，而多肽标签的可用位点是有限的。并且，使用该策略时带标签抗体的表达滴度也是个难点。

8、生产抗体偶联物最直接的方法是利用抗体重链多肽和轻链多肽中天然半胱氨酸的巯基。巯基作为一种强亲核试剂，可在水相中实现快速高效的偶联反应。在fda批准的adc药物例如adcetris和polivy中，通过半胱氨酸残基上的巯基与用于单甲基澳瑞他汀e(mmae)的连接子中的马来酰亚胺基团反应从而将mmae偶联在部分还原链间二硫键产生的半胱氨酸残基上。在此优选部分还原而非完全还原是因为药物的疏水性和所有半胱氨酸残基有连接时的位阻导致adc药物在血浆中不稳定。然而，部分还原后制得的产品均质性很差，对cmc造成了困难，特别是偶联过程的控制和qc达标分析。另一方面，adc混合物中具有不同dar的物质在体内显示出不同的稳定性和疗效，这意味着在异质adc产品中并非所有物质都符合预期结构型式。

9、igg亚类igg1、igg2、igg3和igg4之间在二硫键结构方面有许多相似之处和不同之处。以最常用作治疗用生物药的igg1和igg4为例，igg1和igg4的两条重链都通过两个二硫键连接并且总共有12个链内二硫键；然而，igg1的轻链通过其最后一个残基与重链第五个半胱氨酸残基之间的二硫键与重链相连，而igg4的轻链通过其最后一个半胱氨酸残基与重链第三个半胱氨酸残基之间的二硫键与重链相连。通常，链内二硫键和链间二硫键的溶剂暴露水平不同。链内二硫键都埋置在各个结构域的二级结构之间，不向溶剂暴露。位于铰链区的链间二硫键都高度暴露在溶剂中，包括igg1和igg4的重链-重链间二硫键和igg1的重链-轻链间二硫键。igg4重链-轻链间二硫键位于比较不易触及的vh和ch1结构域界面之间，因此与溶剂的接触度不高。不同二硫键之间的溶剂暴露差异对抗体的生物偶联有重要影响，因为暴露的半胱氨酸残基被认为比不暴露的半胱氨酸残基更有反应性(hongchengliu&kimberly may,igg分子的二硫键结构：结构变化、化学修饰以及对稳定性和生物功能的可能影响(disulfide bond structures of igg molecules:structural variations,chemical modifications and possible impacts to stability and biologicalfunction),mabs,2012,4(1):17-23)。有实验表明，igg1的重链-轻链间二硫键和重链-重链间二硫键均为强反应性。

10、铰链区是抗体fab与fc之间的柔性连接子。igg亚类igg1、igg2、igg3和igg4之间，铰链区的长度和柔性差异很大。以最常用作治疗用生物药的igg1和igg4为例，igg1的铰链区含15个氨基酸，很有柔性，igg4的铰链区较短，仅12个氨基酸(gestur vidarsson,等,igg亚类和同种异型：从结构到效应子功能(igg subclasses and allotypes:from structureto effector functions),front.immunol.,2014,5:520)。野生型igg1和igg4在核心铰链区(eu编号226-229)相差一个氨基酸：igg1中为cys-pro-pro-cys而igg4中为cys-pro-ser-cys。天然igg4在核心铰链区存在链间半胱氨酸二硫键与链内半胱氨酸二硫键之间的平衡，因此可以观察到重链臂交换和分泌后有igg4半抗体分子存在。业已证实，igg4的s228p突变可防止自然臂交换从而显著稳定igg4重链之间的共价相互作用(s.angal等，“单个氨基酸取代消除了嵌合小鼠/人(igg4)抗体的异质性(a single amino acid substitutionabolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(igg4)antibody)”，molecularimmunology,1993,30(1):105-108；john-paul silva等，“新型定量免疫测定法联合生理基质制备证明s228p突变可防止体内和体外igg4 fab臂交换(the s228p mutation preventsin vivo and in vitro igg4 fab-arm exchange as demonstrated using acombination of novel quantitative immunoassays and physiological matrixpreparation)”，journal of biological chemistry,2015,290(9):5462-5469)，因此已广泛用于igg4抗体的开发和生产。s228p突变在igg4铰链中形成多脯氨酸螺旋(下铰链区有5个pro)，配合较短的igg4铰链长度，与igg1铰链(下铰链区有3个pro)相比进一步限制了其柔性。不同铰链之间的柔性差异对抗体的生物偶联具有重要意义，因为柔性铰链片段中的半胱氨酸残基被认为比刚性铰链中的半胱氨酸残基更具反应性。有实验表明，s228p igg4的重链-轻链间二硫键和重链-重链间二硫键均为弱反应性。

11、利用天然半胱氨酸进行抗体偶联的缺点是igg1和igg4中四个链间二硫键之间的反应性相似导致偶联产物高度异质。而如前所述，这种异质性缩小了临床使用的偶联药物的治疗窗口。例如，通过部分还原igg1抗体中的天然链间二硫键而产生的adc会产生具有正态分布的产物混合物。部分还原igg4抗体的产品异质性甚至更高，完全还原的抗体水平已经很高时却仍有很多抗体没有被还原。

12、wuxibodytm(以下亦称“wuxibody”)是药明生物(wuxi biologics)研发的创新双特异性抗体(双抗(bsab)平台。其主要特点是用t细胞受体(tcr)恒定结构域替换抗体fab结构域中的ch1/cl恒定结构域，如pct申请pct/cn2018/106766(国际公开wo2019/057122)所述。wuxibodytm设计可确保同源hc-lc配对。基于wuxibody的bsab可采用不对称形式或可采用对称形式。通过“杵臼”(“kih”)技术，可以确保异二聚体化。

13、尽管如此，仍然需要改善抗体生物偶联的par，特别是对于治疗应用而言，从而尽可能消除部分或全部上述不足。

技术实现思路

1、本公开提供了工程化抗体，其包含具有如wuxibodytm中的tcr恒定结构域的fab结构域、工程化铰链区和具有kih突变的fc结构域。令人惊讶的是，用这种工程化抗体生产的adc具有高均质性和受控良好的dar。这些adc有利地具有高稳定性和极佳治疗效果的特点。

2、在第一方面，本文提供了一种工程化二聚体抗体，其中第一单体包含第一fab结构域和与之可操作性连接的第一工程化铰链区以及在此之后与该铰链区可操作性连接的第一fc区，第二单体包含第二fab结构域和与之可操作性连接的第二铰链区以及在此之后与该铰链区可操作性连接的第二fc区；

3、其中，所述第一fab结构域是抗体fab结构域，所述第二fab结构域包含融合至tcr恒定结构域的抗体fv结构域；以及

4、其中，所述第一工程化铰链区由截短igg1铰链区部分和截短igg4铰链区部分构成或是修饰的igg4铰链区，从而，所述第一工程化铰链区与所述第二铰链区偶联，由其构成的所述铰链结构域包含至少两个链间二硫键；且

5、其中，所述第一fc区与所述第二fc区偶联，由其构成的所述fc结构域包含杵臼突变。

6、另一方面，本文提供一种核酸分子或核酸分子组合，所述核酸分子或核酸分子组合编码本发明的工程化抗体。

7、在另一方面，本文提供了包含本发明工程化抗体的抗体-药物偶联物，本发明的工程化抗体通过连接子偶联一个或多个药物分子。

8、在另一方面，本文提供了一种包含本发明抗体-药物偶联物的混合物或由本发明抗体-药物偶联物的混合物组成的组合物，其中至少约65％、优选至少约70％、至少约75％、至少约80％或至少约90％的抗体-药物偶联物的药物/抗体比为2(dar2)。

9、另一方面，本文还提供了一种包含本发明抗体-药物偶联物的混合物或由本发明抗体-药物偶联物的混合物组成的产品，其中，至少约80％、优选至少约85％、或至少约90％的抗体-药物偶联物的药物/抗体比为6(即dar6)。

10、另一方面，本文提供了一种药物组合物，包含本发明的抗体-药物偶联物和药学上可接受的载体。

11、另一方面，本文提供了一种制备本发明抗体-药物偶联物的方法，包括部分还原的本发明抗体与带有马来酰亚胺或卤代乙酰基部分的连接子-药物载荷化合物通过迈克尔加成反应偶联。

12、另一方面，本文提供了一种用本发明方法获得的抗体-药物偶联物产品，其包含本发明抗体-药物偶联物的混合物或由本发明抗体-药物偶联物的混合物组成，其中至少约65％、优选至少约70％、至少约75％、至少约80％或至少约90％抗体-药物偶联物的药物/抗体比为2。

13、另一方面，本文提供了一种用本发明方法获得的抗体-药物偶联物产品，其包含本发明抗体-药物偶联物的混合物或由本发明抗体-药物偶联物的混合物组成，其中至少约80％、优选至少约85％、至少约90％的抗体-药物偶联物的药物/抗体比为6。

14、另一方面，本文提供了为有需要的对象治疗疾病、紊乱或病症的方法，包括给予所述对象治疗有效量的本发明抗体药物偶联物。所述疾病可以是癌症。

15、再一方面，本文提供了用于为有需要的对象治疗疾病、紊乱或病症的本发明抗体-药物偶联物。所述疾病可以是癌症。

16、本发明具有多项优势。由于使用天然免疫球蛋白g铰链序列并在其天然结构位置发生了交换而不引入任何全新氨基酸序列，因此所得的工程化抗体在体内引起的免疫原性会更少。而且，本发明的工程化抗体可以获得与其igg1或igg4对应参照相当的蛋白质表达滴度。此外，本发明工程化抗体能够获得高度均质的dar受控良好的adc产品。

17、本发明抗体-药物偶联物的生产可显著简化，可以是简单的(一锅式)偶联过程，包括：首先用温和还原剂进行部分还原，然后在同一缓冲系中进行偶联。本发明的adc产品具有高度均质的受控良好的dar，例如，dar2型的百分比超过90％或dar6型的百分比超过87％。此外，本发明的adc具有优异的体外和体内稳定性。

18、通过以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体实施例在显示本发明优选实施方式的同时仅是示例性描述，因为本领域技术人员能够从这些详细描述领会本发明的构思和范围内的各种改变和调整。