在诊断时确定难以治疗的骨肉瘤患者并通过提供新疗法改善其结果的方法与流程

发明领域本发明涉及抗癌治疗领域。具体地，本发明涉及个体中骨肉瘤的预后，并提供了用于确定该预后的体外方法，以及执行该方法的诊断试剂盒。本文还描述了pparγ途径的抑制剂作为抗肿瘤治疗以改善患有不良预后骨肉瘤的患者的总体生存率的用途。

背景技术：

0、发明背景

1、骨肉瘤是青少年和年轻成人中最常见的原发性骨癌，由于多个染色体重排而呈现出高度异质性的基因组和转录组景观1,2。这种异质性使得探索性研究变得复杂，以确定疾病出现或进展潜在的关键致癌驱动因素，并且迄今为止尚未定义常规使用的预后生物标志物或稳健的分层。因此，40年来治疗方法没有发生重大变化，三分之一的骨肉瘤患者仍然经历治疗失败，主要是转移性复发3-7。在过去的20年里，重点是通过从比较基因组杂交阵列(cgh)8-12到全外显子组(wes)1,2,13-16或基因组测序(wgs)17–19的不同的dna分析技术对疾病进行遗传探索，。这些报告了许多与轻度/中度肿瘤适应性增加相关的遗传事件(主要是拷贝数变异，cnv)，但没有任何明确的肿瘤分层。

2、最近已经证明，尽管有常见的表型特征，但原发性骨肉瘤在近中性选择下具有高度多克隆性20。这些观察结果提出了一种可能性，即骨肉瘤主要表型特征是多克隆群落中异源基因组重排的表观遗传或/和转录重编程的新出现的特征。换句话说，进展是肿瘤可塑性的结果。

3、此外，在骨肉瘤的高度受限的骨环境中，评价肿瘤细胞与肿瘤微环境(tme)组成和基质细胞比例或激活状态的共同进化是具有挑战性的21,22。

技术实现思路

1、为了更好地了解骨肉瘤的潜在机制，从而丰富针对这种疾病的医疗手段，发明人推断，转录组景观可以克服这种疾病的遗传复杂性并提供更多可解释的信息。通过无监督的机器学习策略，他们定义了描述骨肉瘤肿瘤克隆和tme的基因组分库。他们观察到，通过共表达的组分相互作用将队列分为预后良好和预后不良的肿瘤。

2、组分的功能表征将预后良好的肿瘤与特定的先天免疫表达相关联，将预后不良的肿瘤与血管生成、破骨细胞和脂肪生成活性相关联，并具有每组特有的不同cnv。这些独特的功能特征可用于对骨肉瘤的治疗进行分层，例如针对g1组肿瘤(预后良好)的免疫调节(例如米伐木肽)，以及针对g2组(难治性)的抗破骨细胞和抗血管生成治疗。

3、发明人还确定了骨肉瘤的潜在生物学途径，包括pparγ、pirna或cta，这些途径突出了新的可操作靶点。

4、最后，他们确定了一组与骨肉瘤有关的37个基因，并证实了15个基因的最小预后特征的预测能力。

5、因此，根据第一方面，本发明涉及用于确定个体中骨肉瘤预后的体外方法，包括测量来自从所述个体获取的生物样品的特征基因的集合的表达水平，将测量的表达水平应用于将所述特征基因的集合的表达水平与骨肉瘤结果相关联的预测模型，并评估所述预测模型的输出以确定所述个体中骨肉瘤的预后。

6、本发明还涉及通过测量来自从个体获得的生物样品的特征基因的集合的表达水平来预测受试者中骨肉瘤进展的诊断试剂盒。

7、本发明的另一个目的是pparγ抑制剂、特别是pparγ拮抗剂在治疗骨肉瘤预后不良的患者中的应用。

8、特别地，本发明提供了用于确定个体中骨肉瘤预后的体外方法，包括：(a)测量来自从所述个体获取的生物样品的特征基因的集合的表达水平，其中所述特征基因的集合包含选自下组的至少两个基因：amz2p1、asxl2、birc6、c11orf58、c1orf53、c5orf28、ccdc34、dcun1d2、dnmt3a、eci1、eif3m、esco1、fam35dp、gage12d、gage12g、hadha、hist2h2aa3、hist2h2aa4、mapk1、meaf6、myo1b、myom3、ndp、paip1、pcid2、peg10、pex26、polr2c、prr14l、ralgapa2、slc2a6、slc7a4、st7l、thap9-as1、timp3、ttpal、wnt4；(b)将步骤(a)中测量的表达水平应用于将所述特征基因的集合的表达水平与骨肉瘤结果相关联的预测模型；和(c)评估所述预测模型的输出以确定所述个体中骨肉瘤的预后。在一些实施方案中，特征基因的集合包括ccdc34和meaf6。在一些实施方案中，所述特征基因的集合包含至少5个，优选至少7个，更优选至少8个选自下组的基因：amz2p1、asxl2、birc6、c11orf58、c1orf53、c5orf28、ccdc34、dcun1d2、dnmt3a、eci1、eif3m、esco1、fam35dp、gage12d、gage12g、hadha、hist2h2aa3、hist2h2aa4、mapk1、meaf6、myo1b、myom3、ndp、paip1、pcid2、peg10、pex26、polr2c、prr14l、ralgapa2、slc2a6、slc7a4、st7l、thap9-as1、timp3、ttpal、wnt4。在一些实施方案中，所述特征基因的集合包含amz2p1、c5orf28、ccdc34、gage12d、meaf6、slc2a6、slc7a4和thap9-as1。在一些实施方案中，所述特征基因的集合包含至少10个，优选至少12个，更优选至少15个选自下组的基因：amz2p1、asxl2、birc6、c11orf58、c1orf53、c5orf28、ccdc34、dcun1d2、dnmt3a、eci1、eif3m、esco1、fam35dp、gage12d、gage12g、hadha、hist2h2aa3、hist2h2aa4、mapk1、meaf6、myo1b、myom3、ndp、paip1、pcid2、peg10、pex26、polr2c、prr14l、ralgapa2、slc2a6、slc7a4、st7l、thap9-as1、timp3、ttpal、wnt4。在一些实施方案中，所述特征基因的集合包括amz2p1、c5orf28、ccdc34、esco1、gage12d、hadha、meaf6、ralgapa2、slc2a6、slc7a4、thap9-as1和timp3。在一些实施方案中，所述特征基因的集合包括amz2p1、asxl2、c11orf58、c5orf28、ccdc34、esco1、gage12d、hadha、meaf6、paip1、ralgapa2、slc2a6、slc7a4、thap9-as1和timp3。在一些实施方案中，所述特征基因的集合包含amz2p1、c5orf28、ccdc34、esco1、fam35dp、gage12d、hadha、hist2h2aa3、hist2h2aa4、mapk1、meaf6、polr2c、ralgapa2、slc2a6、slc7a4、st7l、thap9-as1、timp3和ttpal。

9、在一些实施方案中，在诊断时测量所述特征基因的集合的表达水平。在一些实施方案中，在复发时测量所述特征基因的集合的表达水平。

10、在一些实施方案中，将所述特征基因的基因表达水平与一个或多个其他参数组合以预测所述个体中骨肉瘤的进展。在一些实施方案中，所述一个或多个其他参数选自给予患者的药物、年龄、肿瘤高度和诊断阶段、诊断时存在或不存在转移及其任何组合。

11、在一些实施方案中，生物样品是来自个体的骨肉瘤活检样品。

12、在一些实施方案中，所述方法还包括使用稳定性选择开发所述预测模型。在一些实施方案中，所述方法还包括使用逻辑回归开发所述预测模型。在一些实施方案中，所述方法还包括通过使用稳定性选择用弹性网正则化逻辑回归选择基因来开发所述预测模型。

13、本发明还涉及用于预测受试者中骨肉瘤进展的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种核酸探针或寡核苷酸，其可用于测量来自从所述个体获取的生物样品的特征基因的集合的表达水平的方法中，其中所述特征基因的集合包含至少两个选自下组的基因：amz2p1、asxl2、birc6、c11orf58、c1orf53、c5orf28、ccdc34、dcun1d2、dnmt3a、eci1、eif3m、esco1、fam35dp、gage12d、hadha、hist2h2aa3、hist2h2aa4、mapk1、meaf6、myo1b、myom3、ndp、paip1、pcid2、peg10、pex26、polr2c、prr14l、ralgapa2、slc2a6、slc7a4、st7l、thap9-as1、timp3、ttpal、wnt4。

14、本发明的另一方面是pparγ抑制剂、特别是pparγ拮抗剂在骨肉瘤受试者中作为抗肿瘤治疗的用途。在一些实施方案中，所述受试者是青少年或年轻成人。在一些实施方案中，所述受试者通过上述方法被确定为对化疗的不良反应者。在一些实施方案中，所述抑制剂与另一种抗肿瘤治疗组合使用。在一些实施方案中，所述pparγ抑制剂是t0070907(cas号313516-66-4)。

15、序列表

16、<110>  古斯达威罗斯研究所

17、<120>  在诊断时确定难以治疗的骨肉瘤患者并通过提供新疗法改善其结果的方法

18、<130>  b200148qta

19、<150>  ep21305080.0

20、<151>  2021-01-22

21、<160>  43

22、<170>  patentin version 3.5

23、<210>  1

24、<211>  100

25、<212>  dna

26、<213>  人工序列

27、<220>

28、<223>  rna探针

29、<400>  1

30、aactcttttg aactaagatt tgcctaggtg aataaattgg ggatgacggt tgtctggaga      60

31、agatataagg tccatttgtg aatactctgc actatgagac                           100

32、<210>  2

33、<211>  100

34、<212>  dna

35、<213>  人工序列

36、<220>

37、<223>  rna探针

38、<400>  2

39、ccagcattga cacacaccaa taccacgaag gactaagtaa agcaacccaa gatcagatcc      60

40、ttcagactct cattcagagg gttcggaggc agaatcttct                           100

41、<210>  3

42、<211>  100

43、<212>  dna

44、<213>  人工序列

45、<220>

46、<223>  rna探针

47、<400>  3

48、gtgagcacac acagaatgtg ccattgtcag tcactcttgc aacaagtcct gcacagtttc      60

49、cttgtacgga tggaactgac agaatatctt gctttgggtc                           100

50、<210>  4

51、<211>  100

52、<212>  dna

53、<213>  人工序列

54、<220>

55、<223>  rna探针

56、<400>  4

57、agtccagatg attctgaaag cgattcagag tcagagaaag aagaatctgc tgaagaactc      60

58、caagctgctg agcaccctga tgaagtggag gatcccaaaa                           100

59、<210>  5

60、<211>  100

61、<212>  dna

62、<213>  人工序列

63、<220>

64、<223>  rna探针

65、<400>  5

66、taaactatgt ggatccagct actggctatg tggtgctcac acagattgcc cacttgcaaa      60

67、gaggtgaatg ttgtggctct gcgtgcagac attgtccata                           100

68、<210>  6

69、<211>  100

70、<212>  dna

71、<213>  人工序列

72、<220>

73、<223>  rna探针

74、<400>  6

75、aatgcgaaac ataaacctcg tccagctgca aagagctatg gttatgccaa tggaaaactt      60

76、acaggttttt acagtggaaa ttcctatcca gaaccagcct                           100

77、<210>  7

78、<211>  100

79、<212>  dna

80、<213>  人工序列

81、<220>

82、<223>  rna探针

83、<400>  7

84、gcaggcagtc accaagtctg tatttctagg cctgaccttt tggatcctta tggcaagtgc      60

85、ctccaagtct gcaaatctaa aacaacccat tttgcccatt                           100

86、<210>  8

87、<211>  100

88、<212>  dna

89、<213>  人工序列

90、<220>

91、<223>  rna探针

92、<400>  8

93、ggcacggtcc tgaggcagac aggcatttat tacgctgcct attttcgcat gtggatttca      60

94、gtggcgatgg taaaagcagt ggcaaagatt tccatcagac                           100

95、<210>  9

96、<211>  100

97、<212>  dna

98、<213>  人工序列

99、<220>

100、<223>  rna探针

101、<400>  9

102、gcaacacggc atgtgtcctc tgcagggcgc tgcgttttta tacacgtcaa agctgttaag      60

103、aatgtgccct aagggagagg atcttgtcgt agagtctaat                           100

104、<210>  10

105、<211>  100

106、<212>  dna

107、<213>  人工序列

108、<220>

109、<223>  rna探针

110、<400>  10

111、ggcgagagga ctggccctcc cggctccaga tgttcttcgc taataaccac gaccaggaat      60

112、ttgaccctcc aaaggtttac ccacctgtcc cagctgagaa                           100

113、<210>  11

114、<211>  100

115、<212>  dna

116、<213>  人工序列

117、<220>

118、<223>  rna探针

119、<400>  11

120、acgcagcgcg atgcggacgt gcagaacttc gtcagcttca tctccaaaga ctccatccag      60

121、aagtccctgc agatgtactt agagaggctc aaagaagaaa                           100

122、<210>  12

123、<211>  100

124、<212>  dna

125、<213>  人工序列

126、<220>

127、<223>  rna探针

128、<400>  12

129、gaagagtgat gctgcttcaa aagtcatggt ggaattgctc ggaagttaca cagaggacaa      60

130、tgcttcccag gctcgagttg atgcccacag gtgtattgta                           100

131、<210>  13

132、<211>  100

133、<212>  dna

134、<213>  人工序列

135、<220>

136、<223>  rna探针

137、<400>  13

138、tatgtttgga caaatgccag gtagcggaat tggtactggt ccaggagtta tccaggatag      60

139、attttcaccc accatgggac gtcatcgttc aaatcaactc                           100

140、<210>  14

141、<211>  100

142、<212>  dna

143、<213>  人工序列

144、<220>

145、<223>  rna探针

146、<400>  14

147、ttctcccaaa gggaaaaaac gcaaggtaga acatcagaca gcttgtgctt gtagttctca      60

148、atgcacgcaa ggatctgaaa agtgtcctca gaagactact                           100

149、<210>  15

150、<211>  100

151、<212>  dna

152、<213>  人工序列

153、<220>

154、<223>  rna探针

155、<400>  15

156、cctattattg gcctagacca aggcgctatg tacagcctcc tgaaatgatt gggcctatgc      60

157、ggcccgagca gttcagtgat gaagtggaac cagcaacacc                           100

158、<210>  16

159、<211>  100

160、<212>  dna

161、<213>  人工序列

162、<220>

163、<223>  rna探针

164、<400>  16

165、gggcgagtgc atcgcttgct gcgcaaaggc aactacgcgg agcgagtggg ggccggcgcg      60

166、cccgtctaca tggctgcggt cctcgagtat ctgaccgccg                           100

167、<210>  17

168、<211>  100

169、<212>  dna

170、<213>  人工序列

171、<220>

172、<223>  rna探针

173、<400>  17

174、ccatcttcag caacttgact gggcagcttg attaccaagg ttttgaaaag gccgacatgg      60

175、tgattgaagc tgtgtttgag gaccttagtc ttaagcacag                           100

176、<210>  18

177、<211>  100

178、<212>  dna

179、<213>  人工序列

180、<220>

181、<223>  rna探针

182、<400>  18

183、actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat gagaacatca      60

184、ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca                           100

185、<210>  19

186、<211>  100

187、<212>  dna

188、<213>  人工序列

189、<220>

190、<223>  rna探针

191、<400>  19

192、atttggagcg acagatctat gcttttgagg gaagctacct ggaagacact cagatgtatg      60

193、gcaatattat tcgtggctgg gatcggtatc tgaccaacca                           100

194、<210>  20

195、<211>  100

196、<212>  dna

197、<213>  人工序列

198、<220>

199、<223>  rna探针

200、<400>  20

201、tatgcgcaac aaaagaggta ccagcagaca aagagttccg ccttagtaat tcagtcttat      60

202、atccggggtt ggaaggctcg aaaaattctg cgggaactga                           100

203、<210>  21

204、<211>  100

205、<212>  dna

206、<213>  人工序列

207、<220>

208、<223>  rna探针

209、<400>  21

210、aagttatctc cagccgctga gctacatcta atcttcaaca acaaggagat cttcagctcg      60

211、ccgaaccgca aaatcaattt tgaccgagag aagggcctgg                           100

212、<210>  22

213、<211>  100

214、<212>  dna

215、<213>  人工序列

216、<220>

217、<223>  rna探针

218、<400>  22

219、agaaaacatg tactagctgc atccttttct atgctctccc tgctggtgat aatgggagat      60

220、acagacagta aaacggacag ctcattcata atggactcgg                           100

221、<210>  23

222、<211>  100

223、<212>  dna

224、<213>  人工序列

225、<220>

226、<223>  rna探针

227、<400>  23

228、ttgaacagtt tgcagagacc ctgaatggtt gtgttacaac agatgatgct ttgcaagaac      60

229、ttgtggaact catctatcaa caggccacat ctatcccaaa                           100

230、<210>  24

231、<211>  100

232、<212>  dna

233、<213>  人工序列

234、<220>

235、<223>  rna探针

236、<400>  24

237、tactgaaaac acaccagctg tctctggatg cttttctggt tgccttgaag ttcatgcagg      60

238、tggaggacgt ggacattgac gaagttcagt gtattctggc                           100

239、<210>  25

240、<211>  100

241、<212>  dna

242、<213>  人工序列

243、<220>

244、<223>  rna探针

245、<400>  25

246、tttgccacca ctgcaagcaa aagtctggag aagttcacca acgacaagaa cgattaggga      60

247、aaatatgctg ctgtgggtta acaactcaga aagtccctga                           100

248、<210>  26

249、<211>  100

250、<212>  dna

251、<213>  人工序列

252、<220>

253、<223>  rna探针

254、<400>  26

255、gtttggggac agggactgtg tccatgaaac attccatctt cttggtgaag gcaaggggtt      60

256、ggttcttcag gtcaggatgt taatggagct ggaagttcag                           100

257、<210>  27

258、<211>  100

259、<212>  dna

260、<213>  人工序列

261、<220>

262、<223>  rna探针

263、<400>  27

264、gacatcagta ccaactagaa gtgggtcata gatagattac cagggatgca gtggtgttta      60

265、ggcaggatag gtctttactg gccctgactg ctgttaataa                           100

266、<210>  28

267、<211>  100

268、<212>  dna

269、<213>  人工序列

270、<220>

271、<223>  rna探针

272、<400>  28

273、cgctgtgctc agattcttct cagggtcaaa aggcagaaaa cacacagaat tcgagttctt      60

274、cagagcctca gcctattcaa gagaataaag gacatgtgaa                           100

275、<210>  29

276、<211>  100

277、<212>  dna

278、<213>  人工序列

279、<220>

280、<223>  rna探针

281、<400>  29

282、caggagaaga tgagccactt catgccctgg ttactgccaa tacaatggag aacgtcaaaa      60

283、aggcagtgga acagataaga aacatcctga agcagggtat                           100

284、<210>  30

285、<211>  100

286、<212>  dna

287、<213>  人工序列

288、<220>

289、<223>  rna探针

290、<400>  30

291、agggtgaaca gtatagactt tgtagaattg gagcaccttc aacctgatgt gttagtccac      60

292、gcagtactaa gagttgttga tttcctatac tgacagaggc                           100

293、<210>  31

294、<211>  100

295、<212>  dna

296、<213>  人工序列

297、<220>

298、<223>  rna探针

299、<400>  31

300、gggcgcgggt cgggaccctg cagaacaaaa gggtgttcct ggccaccttc gccgcagtgc      60

301、tcggcaattt cagctttggg tatgccctgg tctacacatc                           100

302、<210>  32

303、<211>  100

304、<212>  dna

305、<213>  人工序列

306、<220>

307、<223>  rna探针

308、<400>  32

309、agagacatat caggggacat taggattggg gaagacactt gactgctaga atcagaggtt      60

310、ggacactata cataaggaca ggctcacatg ggaggctgga                           100

311、<210>  33

312、<211>  100

313、<212>  dna

314、<213>  人工序列

315、<220>

316、<223>  rna探针

317、<400>  33

318、gcctcatgct gaaacttagc tatctgacct gggtgcgctt ctccatctgg ctgctgatgg      60

319、gacttgcagt gtatttcggc tatggcatcc ggcatagcaa                           100

320、<210>  34

321、<211>  100

322、<212>  dna

323、<213>  人工序列

324、<220>

325、<223>  rna探针

326、<400>  34

327、aacctgtcag ctcaggacca tcagaccttt ttcacctgtg acacagattt tttacgtcct      60

328、tcagacacag ttatgcagaa ggcttggagg gaaagaaatc                           100

329、<210>  35

330、<211>  100

331、<212>  dna

332、<213>  人工序列

333、<220>

334、<223>  rna探针

335、<400>  35

336、gaatattggt aagatcgagc aatggcttca ggacatgggt tctcttctcc tgtgatcatt      60

337、caagtgctca ctgcatgaag actggcttgt ctcagtgttt                           100

338、<210>  36

339、<211>  100

340、<212>  dna

341、<213>  人工序列

342、<220>

343、<223>  rna探针

344、<400>  36

345、gctttagagg cgcgggactt ccacacttcc tctccgaagg ccctgcgccg gtgccgtagc      60

346、caatgacagg ccacgttgtg tcccagcagc caatcggaag                           100

347、<210>  37

348、<211>  100

349、<212>  dna

350、<213>  人工序列

351、<220>

352、<223>  rna探针

353、<400>  37

354、acctgccttg ctttgtgact tccaagaacg agtgtctctg gaccgacatg ctctccaatt      60

355、tcggttaccc tggctaccag tccaaacact acgcctgcat                           100

356、<210>  38

357、<211>  100

358、<212>  dna

359、<213>  人工序列

360、<220>

361、<223>  rna探针

362、<400>  38

363、gcatccgaga ctgaaaagac ccatgcttta ctgcagactt gtagcactga atctcttatt      60

364、tccagccttg gtctgggggc attttgcctc gtagctgaca                           100

365、<210>  39

366、<211>  100

367、<212>  dna

368、<213>  人工序列

369、<220>

370、<223>  rna探针

371、<400>  39

372、actgggagtt tgtgtttttc acaggaaccc taagtataga cctctgctgc tcatcaggaa      60

373、acttactgga gatgaaggcc ccagctgttg tcaccgggtt                           100

374、<210>  40

375、<211>  100

376、<212>  dna

377、<213>  人工序列

378、<220>

379、<223>  rna探针

380、<400>  40

381、catcgcgacg gccaaaagga gcggcgcggt cttcgtggtg ttcgtggcag gtgatgatga      60

382、acagtctaca cagatggctg caagttggga agatgataaa                           100

383、<210>  41

384、<211>  100

385、<212>  dna

386、<213>  人工序列

387、<220>

388、<223>  rna探针

389、<400>  41

390、gggtcagccc acagggcttc cagtggtcag gatgctctga caacatcgcc tacggtgtgg      60

391、ccttctcaca gtcgtttgtg gatgtgcggg agagaagcaa                           100

392、<210>  42

393、<211>  22

394、<212>  dna

395、<213>  人工序列

396、<220>

397、<223>  引物

398、<400>  42

399、ttgacttctc cagcatttct ac                                               22

400、<210>  43

401、<211>  21

402、<212>  dna

403、<213>  人工序列

404、<220>

405、<223>  引物

406、<400>  43

407、ctttatctcc acagacacga c                                                21