特异性识别中性粒细胞胞外陷阱的抗裂解的组蛋白H3单克隆抗体的制作方法

本发明涉及一种单克隆抗体3d9，其特异性结合net中裂解的组蛋白h3的c-末端片段，可用于特异性检测net，将其与不同来源的染色质区分开来。本发明还提供了用于体外检测分离的生物样品中的中性粒细胞胞外陷阱的方法，以及用于评估与net形成相关的疾病状况的方法。本发明还涉及在位点l48r49处裂解的人组蛋白h3的分离的纯化片段，以及裂解位点l48r49用于特异性检测人中性粒细胞胞外陷阱的用途。本发明还涉及编码所述多肽的重组核酸序列以及包含所述重组核酸序列的宿主细胞。

背景技术：

1、中性粒细胞胞外陷阱(net)在组织学上被定义为与中性粒细胞颗粒蛋白或胞质蛋白共定位的解聚dna和组蛋白的区域。

2、netosis是中性粒细胞死亡的一种受调节形式，其有助于宿主防御病原体，并且在2004年首次被描述后不久就发现与各种疾病有关。在netosis期间，中性粒细胞排出其染色质，染色质修饰有抗菌蛋白，产生粘性net，可以捕获和杀死病原体，防止病原体传播。这种自我牺牲策略已经启动了一个向自身免疫方向发展的研究领域，因为net的缺陷清除会导致对dna、组蛋白和其他与net相关的细胞内蛋白质的免疫应答5。

3、中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，net)不仅在宿主防御中发挥作用，而且在许多非感染性疾病中发挥作用，所述疾病包括癌症、血栓形成、自身免疫性和神经系统疾病。

4、目前，net通过抗中性粒细胞蛋白(诸如髓过氧化物酶(mpo)或中性粒细胞弹性蛋白酶(ne))和抗染色质抗体以及dna染色的组合来检测。免疫荧光显微镜检查是在组织切片和体外实验中检测net的有用方法。然而，这可能具有挑战性，因为net组分分布在大的解聚结构中，导致信号微弱。例如，中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)抗体的信号在net中比在其中该蛋白酶高度浓缩的静息细胞的颗粒中显著地暗淡。相反，抗组蛋白抗体对幼稚中性粒细胞的net强烈染色，但不会对幼稚中性粒细胞的细胞核染色，后者染色质致密且不易接近。这种差异性组蛋白染色特性目前被开发用于net的检测和定量(brinkmann等人，2012)。然而，样品制备和后续的图像分析使得不同实验室之间的结果难以比较。因此，存在着鉴定针对net抗原的抗体的需求。

5、net也可以根据netosis期间发生的翻译后修饰(ptm)来检测。这些ptm之一是组蛋白3(h3)瓜氨酸化，通过蛋白质精氨酸脱亚胺酶4(pad4)将精氨酸残基转化为瓜氨酸，瓜氨酸是在合成蛋白质时不会掺入蛋白质中的一种氨基酸。瓜氨酸化h3(h3cit)在体外和体内实验中被广泛用作net的替代标志物。重要的是要注意瓜氨酸化作用并非对net形成特异。

6、在netosis期间发生并促成netosis的另一种ptm是通过颗粒衍生的中性粒细胞蛋白酶裂解组蛋白，也称为剪切。半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶的组蛋白裂解是一种名副其实的组蛋白ptm，其有助于大部分去除组蛋白尾部的多个较微小的ptm，并且从酵母到哺乳动物都是保守的。

7、对net在疾病中的作用和作为治疗靶点的研究因缺乏可靠和特异性的检测方法而受到阻碍。没有可用的特异性标记net的抗体。net特异性抗体可用于：(1)研究人员鉴定net和(2)诊断——确定复杂组织是否含有net。

8、本发明的目的是提供一种化合物，更具体地说是一种特异性识别中性粒细胞胞外陷阱(net)的抗体。该抗体还有助于更容易地进行net定量。

9、本发明的目的是通过独立权利要求的教导来解决的。本发明的更多有利特征、方面和细节从本技术的从属权利要求、说明书、附图和实施例中显而易见。

技术实现思路

1、在寻找net的特定标记物时，发明人已经鉴定到了在人net形成中发生的独特组蛋白h3裂解事件，该裂解事件位于人h3 seq id no:25的l48r49处(图1，图2)。

2、发明人利用这一事件的特异性产生了小鼠单克隆抗体3d9(图3)，该抗体针对位于n-末端处的从头组蛋白h3表位(de novo histone h3epitope)，从裂解的组蛋白h3的c-末端片段的r49处开始。换句话说，该抗体特异性结合裂解的组蛋白h3的c-末端片段。

3、通过显微镜检查，该抗体将纯化的(图5)和混合的细胞样品(图6)中的net与染色质区分开来，便于研究中的简单net检测和定量。重要的是，3d9识别由微生物和宿主来源的生理刺激诱导的人类net(图5)。此外，该抗体还检测人体组织切片中的net(图8-10)。该抗体也可用于通过半自动和自动方法进行net定量(图4)。重要的是，抗体3d9可以区分netosis和中性粒细胞中其他形式的细胞死亡(图7a)，而抗染色质抗体pl2.3则不能(图7b)。

4、因此，发明人已经证明，这种抗体是一种检测和量化net的新工具，有助于比较实验室之间的结果，并且是检查活检和其他复杂组织中的net的工具。

5、本发明的抗体识别位于组蛋白h3中位置r49处的从头表位，该表位仅在net形成过程中出现。因此，该抗体是第一个特异性识别net的抗体。

6、到目前为止，组蛋白瓜氨酸化h3cit是用于基于抗体的net检测的唯一ptm家族。在本文中，发明人已经证明了h3r49处的组蛋白裂解作为一种新的组蛋白ptm，可用于广泛检测人类样品中的net。使用h3cit检测net并非没有争议。并非所有net都是瓜氨酸化的，并且在缺失或抑制瓜氨酸化酶的情况下可以发生net形成。通过鉴定精确的组蛋白裂解位点，发明人进一步阐明了这一点。最常用的h3cit抗体检测r2、r8和r17的瓜氨酸化。然而，r49处的组蛋白裂解会去除h3cit表位，使这些限定net的ptm在单个组蛋白水平上互斥。事实上，抗h3cit和3d9在有炎症的肾脏(图8c)、胆囊(图9)和阑尾(图10)石蜡切片中的共染色揭示了这两个标志物的广泛互斥，而3d9对解聚染色质的染色丰度更高。因此，发明人已经表明，3d9将允许广泛检测net，但可能表现出对更成熟或经蛋白水解处理的net的偏好性。

7、与本研究相反，组蛋白裂解最近被报道能区分net形成的不同途径(pieterse等人,2018,annals of the rheumatic diseases 77,1790-1798)。使用夹心elisa方法，pieterse等人得出结论，通常，n-末端组蛋白尾部在nox依赖性而不是非nox依赖性net形成中被去除。他们使用一套针对h2b、h3和h4的n-末端定向抗体，并且所有h3表位都位于裂解位点h3r49的n-末端。然而，在最终的生物样品测试中，作者没有检查h3。有趣的是，该作者观察到，通过免疫荧光显微镜检查，在细胞裂解后的时间点所有组蛋白n-末端抗体都未能染色net。

8、发明人在来自体外实验和组织学样品的固定或变性人体样品中检测到net。

9、因此，h3r49处的组蛋白裂解是任何真核生物体中迄今为止尚未描述的新的裂解位点。

10、不寻常的是，它位于h3的球状而不是非结构化尾部区域。

11、因此，本发明涉及一种特异性结合裂解的组蛋白h3的c-末端片段的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含：

12、a)h-cdr1，其包含seq id no:3的氨基酸序列，或与seq id no:3具有超过90％的序列同一性的氨基酸序列；

13、b)h-cdr2，其包含seq id no:4的氨基酸序列，或与seq id no:4具有超过90％的序列同一性的氨基酸序列；

14、c)h-cdr3，其包含seq id no:5的氨基酸序列，或与seq id no:5具有超过90％的序列同一性的氨基酸序列；

15、d)l-cdr1，其包含seq id no:6的氨基酸序列，或与seq id no:6具有超过90％的序列同一性的氨基酸序列；

16、e)l-cdr2，其包含seq id no:7的氨基酸序列，或与seq id no:7具有超过90％的序列同一性的氨基酸序列；

17、f)l-cdr3，其包含seq id no:8的氨基酸序列，或与seq id no:8具有超过90％的序列同一性的氨基酸序列。

18、本发明还涉及一种特异性结合裂解的组蛋白h3的c-末端片段的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含：

19、i)重链可变区，其包含seq id no:1的氨基酸序列，或与seq id no:1具有超过90％的序列同一性的氨基酸序列；和

20、ii)轻链可变区，其包含seq id no:2的氨基酸序列，或与seq id no:2具有超过90％的序列同一性的氨基酸序列。

21、本发明的优选实施方案针对如上所述的特异性结合裂解的组蛋白h3的c-末端片段的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合片段选自包括下列各项的组：单链可变片段(scfv)、可变结构域(fv)片段、抗原结合片段(fab)片段、f(ab)2片段、肽或含有表位结合区的蛋白水解片段。

22、本发明的另一个优选实施方案针对一种核酸组合物，其包含一个或多个编码如上所述的特异性结合裂解的组蛋白h3的c-末端片段的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。

23、本发明的更优选实施方案针对一种核酸组合物，其包含一个或多个编码如上所述的特异性结合裂解的组蛋白h3的c-末端片段的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，其中所述核酸组合物包含与seq id no:9具有超过90％的序列同一性的核酸序列，和与seq idno:10具有超过90％的序列同一性的核酸序列。

24、本发明的进一步优选的实施方案针对一种宿主细胞，其包含如上所述的重组核酸分子。

25、本发明的另一个实施方案提供了一种用于体外检测分离的生物样品中的中性粒细胞胞外陷阱的方法，所述方法包括：

26、1)将所述分离的生物样品与如上所述的对裂解的组蛋白h3的c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分接触，

27、2)提供足以使所述对裂解的组蛋白h3的c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分与所述分离的生物样品结合的条件，

28、3)确定所述对裂解的组蛋白h3的c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分是否与所述分离的生物样品结合。

29、本发明进一步的实施方案提供了如上所述的方法，其中对裂解的组蛋白h3的c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分与可检测标记物连接。

30、本发明的优选实施方案提供了一种用于体外评估个体的疾病状况的方法：

31、i)将从所述个体获得的分离的生物样品与如上所述的对裂解的组蛋白h3的c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分接触；

32、ii)提供足以使所述对裂解的组蛋白h3的c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分与所述分离的生物样品结合的条件，

33、iii)确定所述对裂解的组蛋白h3的c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分是否与所述分离的生物样品结合，

34、其中所述疾病与net形成有关，

35、其中所述疾病选自包括下列各项的组：血栓性疾病、神经系统疾病、细菌感染性疾病、病毒感染性疾病、真菌感染性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、癌症疾病、癌症转移性疾病。

36、本发明的另一个优选的实施方案提供了如上所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自包括下列各项的组：银屑病；血管炎；系统性红斑狼疮(sle)；类风湿性关节炎；溃疡性结肠炎；克罗恩病；免疫介导的或1型糖尿病；免疫介导的肾小球肾炎；炎症性肠病(ibd)；抗磷脂抗体综合征；免疫性血小板减少症。

37、本发明的另一个优选的实施方案提供了如上所述的方法，其中所述对裂解的组蛋白h3的c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分与可检测标记物连接。

38、本发明的进一步优选的实施方案提供了一种在seq id no:25的位点l48r49处裂解的人组蛋白h3的分离片段，其中在位点l48r49处裂解的人组蛋白h3的片段由seq id no:25的残基r49-a135之间包含的氨基酸序列或其节段组成，或者由seq id no:25的残基a1-l48之间包含的氨基酸序列或其节段组成。

39、在另一个方面，本发明提供了一种用于评估疾病的试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的对c-末端片段特异的抗体或其抗原结合部分，和/或如上所述的人组蛋白h3的片段，其中所述疾病选自包括下列各项的组：血栓性疾病、神经系统疾病、细菌感染性疾病、病毒感染性疾病、真菌感染性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、癌症疾病、癌症转移性疾病。

40、在进一步的方面，本发明提供了如上所述的试剂盒，其中所述自身免疫性疾病选自包括下列各项的组：银屑病；血管炎；系统性红斑狼疮(sle)；类风湿性关节炎；溃疡性结肠炎；克罗恩病；免疫介导的或1型糖尿病；免疫介导的肾小球肾炎；炎症性肠病(ibd)；抗磷脂抗体综合征；免疫性血小板减少症。

41、在特定的方面，本发明提供了位于seq id no:25的l48r49处的组蛋白h3的裂解位点用于特异性检测中性粒细胞胞外陷阱的用途。