本公开涉及用于产生甜菊醇糖苷的酶和生物催化过程。本公开具体涉及可以将葡萄糖部分从adp-葡萄糖供体转移至甜菊醇糖苷的糖基转移酶的用途。
背景技术：
1、过量的糖消耗与世界范围内的健康流行病有关，包括糖尿病和心脏病。医疗保健系统因治疗这些疾病而产生高昂的费用。用低热量、高强度甜味剂代替食品中的添加糖将对健康和经济产生重大影响。
2、甜菊(stevia rebaudiana)物种因其甜叶而广泛种植，在传统上已经用作甜味剂。甜菊提取物的甜度是糖的200-300倍并且在商业上用作高强度甜味剂。甜菊叶的主要糖苷组分是甜菊苷和莱苞迪苷(rebaudioside)。叶中存在大量的十多种不同的甜菊醇糖苷。主要甜味化合物是甜菊苷和莱苞迪苷a。认为莱苞迪苷a(reb a)与甜菊苷相比具有更高的价值，这是因为它的甜味增加并且苦味减少。
3、与reb a相比，莱苞迪苷d(reb d)的甜味和苦味特征有所改善，但甜菊叶中存在的reb d的量极低。可以通过向reb a添加单个葡萄糖分子来制备reb d。制备reb d之天然糖基转移酶使用udp-葡萄糖作为转移至reb a的葡萄糖来源。
技术实现思路
1、本公开提供了酶，特别是非天然酶，以及使用那些酶将糖部分转移至底物甜菊醇糖苷(本文中也称作“sg”)的方法。具体地，在一锅反应中使用β-1，2-糖基转移酶(本文中也称作“b12gt”)和蔗糖合酶(本文中也称作“susy”)以将甜菊苷和reb a分别转化为莱苞迪苷e(reb e)和reb d。
2、与天然糖基转移酶相反，本公开提供了糖基转移酶多肽，所述多肽可以利用adp-葡萄糖作为糖供体以将reb a转化为reb d。本公开提供了糖基转移酶多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：6-882和1333-1466组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。糖基转移酶多肽可以包含选自由seq id no：6-882和1333-1466组成的组的氨基酸序列或由其组成。多肽可以包含一种或多种用于溶解、表达和/或纯化的肽标签；例如，介于4个与10个之间的组氨酸残基并且优选6个组氨酸残基的聚组氨酸标签。其它适合的标签包括但不限于谷胱甘肽s-转移酶(gst)、flag、麦芽糖结合蛋白(mbp)、钙调蛋白结合肽(cbp)和myc标签。适合的接头包括但不限于由甘氨酸和丝氨酸组成的多肽，诸如gsgs、聚甘氨酸接头、eaaak重复序列，以及含有诸如因子xa、肠激酶和凝血酶等酶的切割位点的序列。
3、核苷酸糖供体，包括udp-葡萄糖和adp-葡萄糖两者，是昂贵的共底物并且显著增加利用这些化合物的任何过程的成本。蔗糖合酶(susy；ec 2.4.1.13)催化核苷酸二磷酸(ndp)和蔗糖的化学反应，以形成ndp-葡萄糖和果糖。因此，蔗糖合酶可以用于将ndp转化为b12gt(示例性糖基转移酶)所需的ndp-葡萄糖。本公开提供了susy多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：890-1227和1231-1332组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，所公开的蔗糖合酶可以将adp转化为所公开的b12gt所需的adp-葡萄糖辅因子。
4、另外，本公开提供了一种在一锅反应中利用与b12gt多肽组合的susy adp-葡萄糖再循环系统以将reb a和/或甜菊苷分别转化为reb d和reb e的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使经纯化以含有大于50％reb a(ra50)、adp和蔗糖的甜菊叶提取物与b1，2糖基转移酶和蔗糖合酶接触以制备reb d和/或reb e。
1.一种工程化β-1，2-糖基转移酶多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：6-882和1333-1466组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的工程化β-1，2-糖基转移酶多肽，所述多肽包含与选自由seq idno：6-459组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的工程化β-1，2-糖基转移酶多肽，所述多肽包含与选自由seq idno：460-534组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的工程化β-1，2-糖基转移酶多肽，所述多肽包含与选自由seq idno：535-765组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的工程化β-1，2-糖基转移酶，所述酶包含与选自由seq id no：766-829组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的工程化β-1，2-糖基转移酶，所述酶包含与选自由seq id no：1333-1466组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
7.一种工程化β-1，2-糖基转移酶多肽，当通过表17中所示的pssm进行评分时，所述多肽具有大于266.7的分数。
8.一种多肽，所述多肽具有以下序列：xxxxvxmxpwlxlghxnpxlrxaxxxaxrxxxxxxxxtxxxlxxxxxrixxxyxxxixlxxxxlpxlpelpxxxxttnxlpphlnxxlxxxxxxxxpxxskxxxxxxxxlxxxdxlxxwxxkxaxxxxxpxxxxxtxgxalxxyxxxxxxxxgxxfxfxxixlxxxxxxxxxexxxxxxxxxxfxxxxxxxxxlxxxsrxxeakyxdyxxxxxxxxxvpvgxxxxxxxxxdxxdxelxxwlxxkxxxxxvxvsfgsexflsxexxeexaxglxlsxxnxixvxrfpkgxxxxxxxxlpxgxxxrxxxrxxxxxhlvpqaxilxhxxxggfxshcgwnsxxexxxfgvpiiampmqwdqpinarlxxexgxavexxrxxxgxxxrxxiaxxxxxvxxxxxgxxlrxxvxxxxxxxxxxrxxemxxxxxxxxxlxxxxxaxx
9.如权利要求1所述的工程化β-1，2-糖基转移酶多肽，所述多肽包含与选自由seq idno：830-882组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
10.一种工程化蔗糖合酶多肽，所述多肽包含与seq id no：886至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
11.一种工程化蔗糖合酶多肽，所述多肽包含与seq id no：888至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
12.一种工程化蔗糖合酶多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：890-1227和1231-1332组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的工程化蔗糖合酶多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：890-924组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
14.如权利要求12所述的工程化蔗糖合酶多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：925-1180组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
15.如权利要求12所述的工程化蔗糖合酶多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：1231-1267组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
16.如权利要求12所述的工程化蔗糖合酶多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：1268-1332组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
17.一种工程化蔗糖合酶多肽，当通过表24中所示的pssm进行评分时，所述多肽具有大于556的分数。
18.一种多肽，所述多肽具有以下序列：miexlxxxlxxxxxxxxxxlrxxxxxxrxxxxxxdlxxxxxxfxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxqeaxxxxpwxxxaxrxrxxxwxyxrxhxexlxveexxxxexlxxkexlvxxxxegxavxxxdxxdxxxxxqxxkdestigxgxxhlnrhlxgrxwxdxxxgxxxxxxxlxxhxxxxxxlxlxxxxxxfdxlrxxxqylgxxpxxxpxxxxxxxxxxxgfepgxgxtxxrxrxtxrllxdxldspspxxlexflxrxpxixxxxixsxhgxfxqxxvlgxpdtggqvvxildqxralexexrxrlxxqgxdxepxixxxtrlipxxxgttcdqrlepxxgxxxxxilrxpfrxexgxxxpxwisrfxxwpylerxxxdxexexxaelgxrpdxiignysdgxlxaxxxxxkxgxtqxnxahalekxkyxxsdlxwxxxexxxhfxcqftadxiamnaadxixtstyqeiagxdxxvgqyesxxxxtxpglyrxxxgxdvfdxxfnixspgadxxxyfxyxxxexrxxxlxpeiexxxxxxxxxxxxrgvlxdxxkpxxxxxxrxdriknxxgxxexxgxxxrlrxlanlxxxxghxdxxxsxdxeexxxxxrxhxxxdxxxldgqxrxxgxxlxkxxvgexyrxxadxrgxxxqpalxeafgltviexmxsglpxxatxxggpxeiiexgvsgfhidpnxxxxxxexxadxxexxxxxpxywexisxxalxrvxxrytwxxxaerxxtxxrxxgfwxxvxxrexqvxxrylqmxrhlqxrplahavpxe
19.如权利要求12所述的工程化蔗糖合酶多肽，所述多肽包含与选自由seq id no：1181-1227组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
20.一种工程化蔗糖合酶多肽，当通过表28中所示的pssm进行评分时，所述多肽具有大于569.5的分数。
21.一种多肽，所述多肽具有以下序列：mtxxllxxxxxsxxxxxlxqfxrxlxxxxkxyxlrnxilxafxxycxxxxxpxxxxxxsxlxklxxytqeiixdxexlxwixrpxiaxqevxrlxvxdxtxxpxtixelldxrdrlvnxyhpnxgdxxexdxxpxydyxpxirdxknigxgveflnrxxsskxfqdprqxqxxxxxxxxxhxyngxqlxxnxrirxpxxlxeqxkqxlxxlsdxxxxxxxxexrfelqxlgxepgxgxtxarvrxtlexxxqxxdspdhqvxeaxxsripmxfrxxxxsxhgwfgqexvlgrpdtggqvvxildqxxxlexqxxedxxxaglxxlexxpkixxxtrlipnxegtxcnxrlekxygtxxawilrxpfrefnpkvtqnwixrfeiwpyletxxxdxexexxaexxxxpdxiignysdgnlxafllxrrxkxtqxnxahalekxkylfsxlywqdledkyhfsxqftadlixmnaaxxixsstyqeivgtpdsigqyesyqsftmpxlyxxvngxelfxpkfnvxppgxnexvyfpyxxxxxrxexxxxrleellftledpxxixgxxxxxxkrxxfsmxrxdriknxtglxexxgxxxxlqexcnlxxvagxxxxxxsxdxeexxeiekxxqxxxxyxlxgkxrxlgirlpkxdsgexyrxxadxxgxfxqpalfeafgltilexmixglptfxtxfggpleiiqxxxngfxinptxleexaxxxxxfxxxcxxdpxxwxxxsxxxixrvxxxytwkixxxxxxxlxxixgxwnxxsqenredxxryxeaxxhllxkpraqxllaehlqr
22.一种用于将糖部分转移至底物甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括使b12gt和蔗糖合酶与一种或多种甜菊醇糖苷、非udp核苷酸二磷酸和蔗糖接触。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述b12gt多肽是包含与选自由seq id no：1-882和1333-1466组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的工程化b12gt。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述susy多肽是包含与选自由seq id no：883-1227和1231-1332组成的组的氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的工程化蔗糖合酶。
25.如权利要求22所述的方法，其中
26.如权利要求22所述的方法，其中所述b12gt多肽是当通过表17中所示的pssm进行评分时具有大于266.7的分数的工程化b12gt。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述susy多肽是当通过表24中所示的pssm进行评分时具有大于556的分数的工程化蔗糖合酶。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述susy多肽是当通过表28中所示的pssm进行评分时具有大于194.5的分数的工程化蔗糖合酶。
29.如权利要求22所述的方法，其中
30.如权利要求22所述的方法，其中
31.如权利要求22至30中任一项所述的方法，其中所述底物甜菊醇糖苷是甜菊醇、甜菊醇-13-o-葡萄糖苷、甜菊醇-19-o-葡萄糖苷、甜茶苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、杜尔可苷b、杜尔可苷a、莱苞迪苷b、莱苞迪苷g、甜菊苷、莱苞迪苷c、莱苞迪苷f、莱苞迪苷a、莱苞迪苷i、莱苞迪苷e、莱苞迪苷h、莱苞迪苷l、莱苞迪苷k、莱苞迪苷j、莱苞迪苷m、莱苞迪苷d、莱苞迪苷n、莱苞迪苷o、莱苞迪苷q、其异构体、合成甜菊醇糖苷，或它们的组合。
32.如权利要求22至30中任一项所述的方法，其中所述底物甜菊醇糖苷是甜菊苷和莱苞迪苷a的混合物。
33.如权利要求22至32中任一项所述的方法，其中所述目标甜菊醇糖苷是甜菊醇、甜菊醇-13-o-葡萄糖苷、甜菊醇-19-o-葡萄糖苷、甜茶苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、杜尔可苷b、杜尔可苷a、莱苞迪苷b、莱苞迪苷g、甜菊苷、莱苞迪苷c、莱苞迪苷f、莱苞迪苷a、莱苞迪苷i、莱苞迪苷e、莱苞迪苷h、莱苞迪苷l、莱苞迪苷k、莱苞迪苷j、莱苞迪苷m、莱苞迪苷d、莱苞迪苷n、莱苞迪苷o、莱苞迪苷q、其异构体、合成甜菊醇糖苷，或它们的组合。
34.如权利要求22至32中任一项所述的方法，其中所述目标甜菊醇糖苷是莱苞迪苷e和莱苞迪苷d的混合物。
35.如权利要求22至32中任一项所述的方法，其中所述目标甜菊醇糖苷是莱苞迪苷d。
36.如权利要求22至32中任一项所述的方法，其中所述目标甜菊醇糖苷是莱苞迪苷e。
37.如权利要求22至36中任一项所述的方法，其中所述非udp核苷酸二磷酸是adp、gdp、cdp或tdp。
38.如权利要求22至37中任一项所述的方法，其中所述非udp核苷酸二磷酸是adp。
39.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1-18中任一项所述的多肽。
40.一种宿主微生物，所述宿主微生物异源表达如权利要求36所述的多核苷酸。