背景技术：
0、现有技术
1、借助于分子生物学方法研究各种水样变得越来越重要。sars-cov-2大流行显示出，研究来自污水处理设备的废水可能在流行病学上早期检测感染数量升高方面是有意义的。除了对水进行一般微生物研究之外，人们还越来越多地关注抗生素耐药性的检测。这些耐药性通常不是与细菌相关联的，而是作为自由循环的质粒存在。但是从水样/废水样中分离核酸有许多问题。在研究血氧是否存在病毒感染时200μl的体积就已经足够，而在研究水/废水时的样品体积要大得多。但是约20ml的样品体积不再能直接用于简单快速的核酸提取。
2、在此背景下还有问题的是，例如废水或工业处理水包含大量的固体和基质。湖或河的地表水也包含相对大浓度的固体。为了减少这些物质或将其从样品中去除，只是为了使液相可用于分析，可以通过离心来去除固体物质。去除这些物质的其他可能性是过滤技术、使用带电过滤器还有絮凝法。在此显现出了严重影响分析方法灵敏度的较大问题。已知的是，生物分子结合到位于水中的固体上。由此，当在提取之前从样品中去除沉降物并且仅用所产生的上清液工作时，这部分待检测的生物分子由于沉降而损失掉。另一方面，通常还只用沉降物而不用上清液进行工作。依据使用哪种变体，总是有相应未使用级分中的生物分子损失掉。从这两个级分中同时分离核酸的方法是未知的。
3、要注意的是，存在一系列的技术将生物分子从大体积的样品中浓缩。
4、于是例如使用超离心技术来从生物样品中富集病毒或亚细胞颗粒。此外还使用超滤技术。该方法也费时并且非常昂贵。替代的方法在于借助聚乙二醇/氯化钠使病毒颗粒沉淀以及随后的离心(yamamoto等人，virology40(1970)734；morandi等人，j.clin.microbiol.36(1998)1543-1538)。在此使用peg和氯化钠的不同混合物，并且将这些反应试剂与生物样品混合。随后将混合物低温培养较长时间，随后通过离心获得病毒(蛋白质)-nacl/peg-沉淀物。这些方法也很麻烦并且需要很多时间。除此之外，继续处理沉淀物以便分离病毒核酸也是有问题的。常常很难使沉淀物重新进入溶液。这显著影响核酸分离的效率和质量。专利文件de 19856415 c2描述了一种方法，该方法使用已知的nacl/peg沉淀过程来工作，其中随后以本身已知的方式通过键合到硅酸盐型固相来实现核酸的分离。尚不清楚该方法与具有已知问题的充分已知的nacl/peg沉淀方法有多少差别。除此之外，该方法还需要低温培养以及二十分钟的离心。该方法应当可以从最多10ml的样品中分离病毒核酸。最后，所有这些方法都是非常费时费力的并且还需要特殊的昂贵的设备(例如超离心机)。
5、发明目的
6、本发明的目的在于克服已知技术方案的缺点。本发明的目标因此在于提供一种简单的且可快速执行的方法，所述方法能够从位于水样中的不同生物分子中同时分离核酸。
技术实现思路
1、已经根据本专利权利要求所述的特征实现了这个目的。在此，从在离心之后获得的沉降物以及离心之后产生的液相中进行根据本发明的同时和并行-同时分离。借助于简单的离心来进行沉降物和液相的分离。所述方法确保了，通过同时处理沉降物和所获得的液相，不产生核酸损失并且由此可以显著提高分子基因检测法的灵敏度。
2、此外，所述方法还可以从自身仅在沉降物中的生物分子(例如细菌)中提取核酸、提取在离心之后大体上位于液相中的生物分子(例如循环的游离的dna、噬菌体或病毒)。
3、通过本发明出人意料地简单地解决了这个问题。在此，可以采用可商购的提取试剂。为了能够实现目的，起决定作用的是其组合。从沉降物和所获得的上清液中同时分离核酸如下实现：将20ml的水样、例如来自污水处理厂的废水转移到50ml的离心容器中。在5,000rpm下将样品离心20分钟，以便将沉降物与上清液分离并且获得无沉降物的液相。完全取出上清液。将其中10ml转移到新的离心容器中用于进一步处理。用1xpbs缓冲液将沉降物再悬浮并且转移到新的1.5ml离心容器中。现在这两个级分都准备好用于同时提取核酸。现在在上清液中存在无法借助于简单的离心而沉降的生物分子(游离的核酸、噬菌体、病毒等)。已浓缩所获得的生物分子为目的的对上清液(10ml)的处理是基于使用多糖衍生物来将样品中包含的生物分子络合。该多糖衍生物为多糖醛酸的盐。海藻酸的所谓藻酸盐在此特别适用。藻酸盐为褐藻中的形成结构的单元。藻酸盐是一种由1,4连接的α-l-古罗糖醛酸(g)和β-d-甘露糖醛酸(m)组成的多糖。这在公开文件de 10 2008 023 297 a1(还有wo2009/135936a1和us 020110117628 a1)中公开。该文件描述了利用藻酸盐在具有低钙含量的溶液中凝胶化并且形成所谓的水凝胶的能力。凝胶化的原因在于钙离子嵌入到gg嵌段的之字形结构中。然后另一个藻酸盐分子的之字形结构支承于该区域上。从而形成三维结构。与强酸组合也形成凝胶。除此之外，所产生的凝胶结构也能够再次被特异性地破坏。但是关于在水样中可沉降和不可沉降的生物分子的情况下的方法中应用这一技术方案无法得出任何结论，因为仍然不清楚用这种方法通过形成凝胶是只富集了来自液相的生物分子还是也富集了来自沉降物相的生物分子。这已经在表1(第[0030]和[0031]段)中进行说明。
4、在充分利用藻酸盐凝胶的形成的情况下能够简单且迅速地富集生物分子(病毒、噬菌体、游离的核酸等)并且随后进行核酸的分离。
5、因此，向液相(10ml上清液)中加入藻酸盐溶液和氯化钙溶液。将混合物短暂晃动、培养并随后在5,000rpm下离心20分钟。去除上清液并且用丸料进行进一步处理。这个步骤可以将10ml的样品体积浓缩到少数几微升。
6、将浓缩之后获得的丸料与可商购的细胞溶解缓冲液(细胞溶解溶液rl；耶拿分析仪器股份公司analytik jena ag)混合。借助于细胞溶解缓冲液将丸料溶解。由此液相的生物分子现在存在于细胞溶解缓冲液中。再悬浮在pbs缓冲液中的沉降物级分如下处理：
7、取决于应从沉降物中的哪些生物分子中提取核酸(例如来自已经结合到沉降物组分的病毒或游离核酸，或者来自由于上述离心同样已经成为沉降物的组成部分的细菌)，将沉降物级分短暂离心并且直接继续使用上清液，或者预先以酶或热的方式对再悬浮的沉降物进行细胞溶解、随后离心并且在这种细胞溶解之后将上清液用于进一步提取。将上清液加入到含有来自液相的细胞溶解缓冲液的容器中。现在，来自液相和沉降物级分的所有生物分子都在细胞溶解缓冲液之下处于反应容器中。
8、现在可以借助于本领域技术人员已知的方法来进行核酸提取。为此，在短暂的细胞溶解步骤之后，在加入结合缓冲液的情况下将核酸结合到固相(例如包含有玻璃纤维隔膜或者磁性或顺磁性颗粒的旋转过滤器)。然后进行清洗，并且最终在加入水或低盐缓冲液之后使核酸从固相脱离。当前情况下的核酸由沉降物级分和上清液级分的生物分子加和而成，这些级分是在第一步骤中由20ml的废水样获得的。整个方法仅需要略大于一小时。该方法既可以手动进行也可以自动进行。该方法不需要通常处理水样所使用的超离心或超滤技术。该方法可以实现从包含于样品中的所有生物分子中提取核酸。
9、从这两种级分中并行地提取生物分子的方法还可以再被简化。可能有利的是，样品体积更小(优选小于15ml)。在此，完全不将样品分离为沉降物级分和液相。向整个样品(例如10ml)中加入藻酸盐溶液和氯化钙溶液。将混合物短暂晃动、培养并随后在5,000rpm下离心20分钟。去除上清液并且用丸料进行进一步处理。沉降物以及液相的经浓缩的生物分子现在处于丸料中。再次将丸料与可商购的细胞溶解缓冲液(细胞溶解溶液rl；耶拿分析仪器股份公司)和蛋白酶k混合、转移到1.5ml的反应容器中并且随后在60℃培养20分钟。然后在最大速度下将混合物离心几分钟并且将上清液转移到新的反应容器中。现在可以再次借助于已知的方法来进行核酸提取。为此，在短暂的细胞溶解步骤之后，在加入结合缓冲液的情况下将核酸结合到固相(例如包含有玻璃纤维隔膜或者磁性或顺磁性颗粒的旋转过滤器)。然后进行清洗，并且最终在加入水或低盐缓冲液之后使核酸从固相脱离。当前情况下的核酸由沉降物级分和上清液级分的生物分子加和而成，这些级分是在第一步骤中由10ml的废水样获得的。这种方法可以更快地进行，因为它不需要分离沉降物和液相。
10、除了同时提取之外，在理想状况下，该方法还可以用于同时并行地分离来自沉降物和所获得的上清液的核酸。在此，仅省去了沉降物级分和上清液级分的合并。这两种级分分别作为分开的样品被并行处理。然后所获得的核酸就是来自各自级分的核酸。
11、根据本发明的用于从水样中可沉降和不可沉降的生物分子的混合物中同时地或并行同时地分离核酸的方法的特征在于以下步骤：
12、a)将样品分离为沉降物级分和液相。为此优选使用离心机。尤其游离的核酸和没有沉降的细胞位于不可沉降的相(上清液)中。
13、b)由于较大的体积不适合于核酸分离，通过加入多糖衍生物、优选使用藻酸盐，将液相的不可沉降的生物分子富集在丸料中。优选向液相中加入钙盐。于是液相的所有细胞和生物分子都处于丸料中。
14、c)通过加入细胞溶解缓冲液溶解丸料。在此不仅溶解丸料，而且还将实际存在的细胞溶解。
15、d)对沉降物级分进行细胞溶解并且将经细胞溶解的组成成分转移到另外的液相中。通过这种细胞溶解，释放了沉降相的组成成分的核酸。
16、e)将这两个液相合并并且将核酸固定到固相上，或者将这两个液相的核酸分别固定，并且根据已知的方法将其纯化和洗脱。
17、根据本发明的用于从水样中可沉降和不可沉降的生物分子的混合物中同时地分离核酸的方法的一种简单的变体的特征在于以下步骤：
18、a)通过加入多糖衍生物，将所述液相的不可沉降的生物分子富集在丸料中，不将所述沉降物分离出来
19、b)通过加入细胞溶解缓冲液溶解所述丸料，并且对所述沉降物级分进行细胞溶解并将经细胞溶解的组成成分转移到另外的液相中
20、c)将这些液相的核酸固定到固相上，并且根据已知的方法将其纯化和洗脱。
21、该分离过程取消了液相和沉降物相。这种变体在最多15ml的体积下具有其优势。
22、细胞溶解、通过细胞溶解释放的核酸的固定以及纯化是本领域技术人员已知的。一种可能的方法是磁性分离。但是，将核酸固定到粗糙表面上也是可能的(根据wo 2016/169677 a1)。
23、根据本发明的方法的用途是确定水样中可沉降和不可沉降的生物分子的混合物中的核酸总含量。这种确定对应于核酸的同时分离。同样，根据本发明的用途是确定水样中可沉降和不可沉降的生物分子的混合物中的可沉降和/或不可沉降组成成分的核酸含量。
24、下面将借助于实施例详细阐释本发明，其中这些实施例并不意味着对本发明所述方法的限制。
25、实施例
26、实施例1：同时提取以及同时并行提取包含在水样中的细菌的核酸以及游离噬菌体rna
27、作为初始样品，从哈弗尔河(havel)采取了地表河水。将细菌(沙门氏菌)以及噬菌体rna(ms2-rna)掺入样品中。
28、为了提取核酸，将样品分离为沉降物级分和液相。总是使用20ml的初始样品。可以假定，细菌位于沉降物中并且游离rna作为不可沉降生物分子位于液相中，但是在某些情况下还有一部分游离核酸固定到样品的浮游物质上并且由此为沉降物的一部分。目的是简单且快速地分离细菌核酸以及游离核酸。
29、通过从这两种级分中同时提取核酸，应获得最大可能的产率。除了从这两种级分中同时提取之外，还从沉降物和液相中进行同时并行提取，以便显示哪些生物分子位于哪个级分中。
30、根据本发明的方法如下进行提取。将20ml的样品在50ml的反应容器中在5,000rpm下离心20分钟。将上清液取出并且将其中10ml转移到新的容器中。
31、1.从沉降物和液相中同时并行提取核酸
32、1.1.从液相中提取核酸
33、向10ml液相中加入100μl的藻酸盐溶液和100μl氯化钙溶液。将混合物短暂晃动、培养10分钟并且随后在5,000rpm下离心20分钟。在这次离心之后，去除上清液并且将丸料与500μl的细胞溶解缓冲液(细胞溶解溶液rl；耶拿分析仪器)混合并且通过多次用滴管滴加来溶解丸料、将其转移到新的1.5ml反应容器中并与20μl的蛋白酶k混合并在60℃下培养15分钟。向样品加入50μl的磁性颗粒溶液以及450μl的结合缓冲液(结合溶液sbs；耶拿分析仪器)。将混合物短暂混合并且培养2分钟。然后借助磁体分离了磁性颗粒。去除上清液并且用1ml的清洗缓冲液(清洗溶液hs；耶拿分析仪器)清洗磁性颗粒。再次分离磁性颗粒之后完全去除上清液，并且继续用80％的乙醇清洗磁性颗粒两次。随后在恒温混匀仪(thermomixer)中将反应容器在50℃下开盖培养10分钟。通过加入50μl的不含rna酶的水并且在60℃下培养5分钟进行洗脱。在分离磁性颗粒之后去除上清液并且转移到新的容器中。该容器现在仅包含来自液相的核酸。
34、1.2.从沉降物中提取核酸
35、将离心之后获得的沉降物丸料再悬浮在250μl的1pbs缓冲液中，并且在加入10ml溶菌酶之后在37℃下培养30分钟。随后在12,000rpm下将沉降物样品离心2分钟并且将上清液转移到新的反应容器中并与300μl的细胞溶解缓冲液(细胞溶解溶液rl；耶拿分析仪器)以及20μl蛋白酶k混合并在60℃下培养15分钟。向样品加入50μl的磁性颗粒溶液和450μl的结合溶液sbs(耶拿分析仪器)。将混合物短暂混合并且培养2分钟。然后借助磁体分离了磁性颗粒。去除上清液并且用1ml的清洗缓冲液(清洗溶液hs；耶拿分析仪器)清洗磁性颗粒。再次分离磁性颗粒之后完全去除上清液，并且继续用80％的乙醇清洗磁性颗粒两次。随后在恒温混匀仪(thermomixer)中将反应容器在50℃下开盖培养10分钟。通过加入50μl的不含rna酶的水并且在60℃下培养5分钟进行洗脱。在分离磁性颗粒之后去除上清液并且转移到新的容器中。该容器现在仅包含来自沉降物的核酸。
36、2.从沉降物和液相中同时提取核酸
37、将离心之后获得的沉降物丸料再悬浮在250μl的1pbs缓冲液中，并且在加入10ml溶菌酶之后在37℃下培养30分钟。在培养时间期间向来自液相的10ml中加入100μl藻酸盐溶液和100μl氯化钙。将混合物短暂晃动、培养10分钟并且随后在5,000rpm下离心20分钟。在这次离心之后，去除上清液并且将丸料与300μl的细胞溶解溶液rl(耶拿分析仪器)混合并且通过多次用滴管滴加来溶解丸料并转移到新的1.5ml反应容器中。在对沉降物样品进行细胞溶解之后，在12,000rpm下将其离心2分钟，然后将上清液加入到来自液相的已经处于细胞溶解溶液rl下的样品。由此将这两个样品合并以便进一步处理。在加入蛋白酶k之后在60℃下继续培养样品15分钟。向样品加入50μl的磁性颗粒溶液和450μl的结合溶液sbs(耶拿分析仪器)。将混合物短暂混合并且培养2分钟。然后借助磁体分离了磁性颗粒。去除上清液并且用1ml的清洗缓冲液(清洗溶液hs；耶拿分析仪器)清洗磁性颗粒。再次分离磁性颗粒之后完全去除上清液，并且继续用80％的乙醇清洗磁性颗粒两次。随后在恒温混匀仪(thermomixer)中将反应容器在50℃下开盖培养10分钟。通过加入50μl的不含rna酶的水并且在60℃下培养5分钟进行洗脱。在分离磁性颗粒之后去除上清液并且转移到新的容器中。该容器现在包含来自沉降物以及来自液相的核酸。
38、为了检验细菌和游离噬菌体rna处于哪个级分(沉降物和液相)中，借助于实时pcr来测试所进行的每一个提取变体所获得的核酸。在此分别利用专用的分析来进行沙门氏菌dna和噬菌体rna的检测。下面在表中详述根据实时pcr的ct值。
39、表1：
40、 样品 沙门氏菌 噬菌体rna 样品1(沉降物) 19.5 27.5 样品2(沉降物) 19.5 27.6 样品1(液相) 无法检测到 26.0 样品2(液相) 无法检测到 25.9 样品3(沉降物+液相) 19.5 25.4 样品4(沉降物+液相) 19.6 25.2
41、这些数据确认了先前的假设，即细菌位于沉降物中，而游离噬菌体rna主要位于液相中、但是也已一定比例位于沉降物中(约70％在液相中并且30％在沉降物中)。
42、这些结果令人印象深刻地显示出，仅将一个级分用于从细菌或游离噬菌体rna中提取核酸可能无法获得核酸或者产率不够高。这种同时分离的方法简单且快速地检测了所有待分离的目标并且由此允许获取最大核酸产率。
43、实施例2：同时提取包含在水样中的细菌的核酸以及游离噬菌体rna和游离的质粒dna
44、作为初始样品，从消防水池中采取了严重污染的水。向样品中加入细菌(沙门氏菌)、合成质粒dna和噬菌体rna(ms2-rna)。
45、为了提取核酸，将样品分离为沉降物级分和液相。总是使用20ml的初始样品。可以假定，细菌位于沉降物中并且游离rna和游离质粒dna作为不可沉降生物分子位于液相中，但是在某些情况下还有一部分游离核酸固定到样品的浮游物质上并且由此为沉降物的一部分。目的是简单且快速地分离细菌核酸以及游离核酸。在这个实施例中，核酸不是结合到磁性颗粒上，而是结合到具有玻璃纤维隔膜的旋转过滤器上。
46、根据本发明的方法如下进行提取。将20ml的样品在50ml的反应容器中在5,000rpm下离心20分钟。将上清液取出并且将其中10ml转移到新的容器中。
47、将离心之后获得的沉降物丸料再悬浮在250μl的1pbs缓冲液中，并且在加入10ml溶菌酶之后在37℃下培养30分钟。在培养时间期间向来自液相的10ml中加入100μl藻酸盐溶液和100μl氯化钙。将混合物短暂晃动、培养10分钟并且随后在5,000rpm下离心20分钟。在这次离心之后，去除上清液，将丸料与300μl的细胞溶解溶液rl(耶拿分析仪器)混合、通过多次用滴管滴加来溶解丸料并转移到新的1.5ml反应容器中。在对沉降物样品进行细胞溶解之后，在12,000rpm下将其离心2分钟，然后将上清液加入到来自液相的已经处于细胞溶解溶液rl下的样品。由此将这两个样品合并以便进一步处理。在加入蛋白酶k之后在60℃下继续培养样品15分钟。向样品加入450μl的结合溶液sbs(耶拿分析仪器)。将混合物短暂混合、置于旋转过滤器柱上在11,000x g下离心1分钟。丢弃滤液。随后将旋转过滤器柱分别用600μl的清洗缓冲液(清洗溶液hs；耶拿分析仪器)清洗两次或者用80％的乙醇清洗两次。在最后一个清洗步骤之后，在最大速度下将旋转过滤器柱离心3分钟并且随后将旋转过滤器柱插入空的反应容器中。然后向旋转过滤器柱加入100μl的不含rna酶的水，并且随后在11,000x g下离心一分钟。该容器现在包含来自沉降物以及来自液相的核酸。根据本发明可以从这两个级分中简单快速地分离可能的核酸。
48、借助于实时pcr对所分离的细菌dna、质粒dna和噬菌体rna进行检测。下面在表中详述根据实时pcr的ct值。
49、表2：
50、 样品 沙门氏菌 噬菌体rna 质粒dna 样品1(沉降物+液相) 25.0 22.5 24.5 样品2(沉降物+液相) 24.8 22.2 24.4
51、实施例3：在没有预先分离沉降物和液相的情况下同时提取包含在水样中的细菌的核酸以及游离噬菌体rna和游离的质粒dna
52、作为初始样品，从消防水池中采取了严重污染的水。向样品中加入细菌(沙门氏菌)、合成质粒dna和噬菌体rna(ms2-rna)。
53、使用了10ml的样品。将样品转移到15ml反应容器中并且加入100μl藻酸盐溶液和100μl氯化钙。将混合物短暂晃动、培养10分钟并且随后在5,000rpm下离心20分钟。在这次离心之后，去除上清液，将丸料与500μl的细胞溶解溶液rl(耶拿分析仪器)混合、通过多次用滴管滴加来溶解丸料并转移到新的1.5ml反应容器中并与20μl的蛋白酶k溶液混合。在60℃下培养20分钟后，将混合物在14,000rpm下离心3分钟并且将上清液转移到新的1.5ml反应容器中。然后向样品加入200μl的结合缓冲液(结合溶液sbs；耶拿分析仪器)。将混合物短暂混合、置于旋转过滤器柱上在11,000x g下离心1分钟。丢弃滤液。随后将旋转过滤器柱分别用600μl的清洗缓冲液(清洗溶液hs；耶拿分析仪器)清洗两次或者用80％的乙醇清洗两次。在最后一个清洗步骤之后，在最大速度下将旋转过滤器柱离心3分钟并且随后将旋转过滤器柱插入空的反应容器中。然后向旋转过滤器柱加入100μl的不含rna酶的水，并且随后在11,000x g下离心一分钟。该容器现在包含来自沉降物以及来自液相的核酸。根据本发明可以在不将这两个级分预先分离的情况下从这两个级分中简单快速地分离可能的核酸。
54、借助于实时pcr对所分离的细菌dna、质粒dna和噬菌体rna进行检测。下面在表中详述根据实时pcr的ct值。
55、表3：
56、 样品 沙门氏菌 噬菌体rna 质粒dna 样品1(沉降物+液相；未分离) 23.7 25.5 26.5 样品2(沉降物+液相；未分离) 23.8 26.2 27.3