用于治疗与血管生成相关的眼部疾病的组合物和方法与流程

背景技术：

技术实现思路

1、公开了用于治疗与眼部血管生成相关的眼部疾病的组合物和方法，所述眼部疾病包括但不限于湿性(新生血管性、渗出性)年龄相关性黄斑变性；视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿；视网膜静脉阻塞引起的视网膜新生血管形成；糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变(包括非增生性糖尿病性视网膜病变和增生性糖尿病性视网膜病变的所有阶段)；近视性黄斑变性；视网膜分支静脉阻塞、半侧视网膜静脉阻塞和视网膜中央静脉阻塞；早产儿视网膜病变；特发性脉络膜新生血管形成；近视黄斑变性和继发性视网膜和脉络膜新生血管形成；视网膜毛细血管扩张；新生血管性青光眼；玻璃体出血；继发于视网膜疾病的视网膜和脉络膜新生血管形成，所述视网膜疾病包括但不限于葡萄膜炎、创伤、视网膜退行性疾病、遗传性视网膜和/或脉络膜疾病、眼肿瘤、角膜和虹膜新生血管形成。在一些实施方案中，血管生成性眼部疾病选自湿性(新生血管性、渗出性)年龄相关性黄斑变性；糖尿病性黄斑水肿；视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿；糖尿病性视网膜病变；和近视性脉络膜新生血管形成。

2、在一些实施方案中，提供了一种核酸，其包含(i)编码第一抗血管生成多肽(例如阿柏西普)的核苷酸序列和(ii)编码一种或多种降低一种或多种促血管生成靶基因的表达的干扰rna分子的核苷酸序列。在一些方面，rna分子是短发夹rna(shrna)。在另一些方面，rna分子是初级mirna分子。在一些方面，核酸包含表达盒，所述表达盒包含(i)可操作地连接至表达控制序列的编码第一抗血管生成多肽的核苷酸序列，和(ii)可操作地连接至表达控制序列的编码降低一种或多种促血管生成靶基因的表达的干扰rna分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码抗血管生成多肽的核苷酸序列和编码干扰rna分子的核苷酸序列可操作地连接至不同的表达控制序列。在优选实施方案中，抗血管生成多肽和干扰rna分子的表达由共同的(即相同的)表达控制序列驱动。在一些方面，表达控制序列包含组成型启动子，诸如cag或cba启动子。在另一些方面，表达控制序列包含细胞特异性启动子。

3、在一些实施方案中，核酸包含编码靶向血管生成素-2(亦称ang2或ang-2)的干扰rna分子的核苷酸序列。代表性人ang2序列可见于例如ncbi检索号015123和美国专利号8,987,420(其内容通过引用并入本文)的seq id no:517和518。在优选实施方案中，干扰rna分子靶向ang-2并包含有义链和反义链，所述有义链和反义链包含选自下表1中列举的那些的序列、基本上由其组成或由其组成：

4、表1：靶向人ang-2的干扰rna

5、

6、

7、在一些实施方案中，干扰rna分子包含有义链和反义链，其中的一种或两种包含以下序列、基本上由其组成或由其组成：与选自表1中列举的那些的序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性的序列。在一些特别优选的实施方案中，核酸包含编码作为阿柏西普的第一抗血管生成多肽的核苷酸序列和编码靶向人血管生成素-2的干扰rna分子的核苷酸序列。

8、在一些优选实施方案中，核酸包含编码靶向vegf-c的干扰rna分子的核苷酸序列。代表性人vegf-c序列可见于例如genbank检索号nm—005429和x94216。在优选实施方案中，干扰rna分子靶向vegf-c并包含有义链和反义链，所述有义链和反义链包含选自下表2中列举的那些的序列、基本上由其组成或由其组成：

9、表2：靶向人vegf-c的干扰rna

10、

11、在一些实施方案中，干扰rna分子包含有义链和反义链，其中的一种或两种包含以下序列、基本上由其组成或由其组成：与选自表2中列举的那些的序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性的序列。靶向vegf-c的另外的干扰rna分子包括美国专利申请公开号2011/0293625a1的表1中列举的那些，其内容通过引用并入本文。在一些特别优选的实施方案中，核酸包含编码作为阿柏西普的第一抗血管生成多肽的核苷酸序列和编码靶向人vegf-c的干扰rna分子的核苷酸序列。

12、在相关实施方案中，核酸包含编码第一抗血管生成蛋白(例如阿柏西普)的核苷酸序列，并进一步包含靶向人vegf-c的干扰rna分子和靶向人ang-2的干扰rna分子。

13、在另一些实施方案中，核酸包含编码靶向vegfr-3的干扰rna分子的核苷酸序列。代表性人vegfr-3序列可见于例如genbank检索号x68203。在优选实施方案中，干扰rna分子靶向vegfr-3并包含有义链和反义链，所述有义链和反义链包含选自下表3中列举的那些的序列、基本上由其组成或由其组成：

14、表3：靶向人vegfr-3的干扰rna

15、

16、在一些实施方案中，干扰rna分子包含有义链和反义链，其中的一种或两种包含以下序列、基本上由其组成或由其组成：与选自表2中列举的那些的序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性的序列。靶向vegfr-3的另外的干扰rna分子包括美国专利号7,517,864的表2中列举的那些，其内容通过引用并入本文。在一些特别优选的实施方案中，核酸包含编码作为阿柏西普的第一抗血管生成多肽的核苷酸序列和编码靶向人vegfr-3的干扰rna分子的核苷酸序列。

17、在一些实施方案中，合成rna分子是小干扰rna(sirna)。在一些实施方案中，干扰rna是小发夹rna(shrna)。在一些方面，shrna具有包含(5'至3')序列ctcgag或与其具有至少70％或至少80％的同一性的序列的环。

18、在一些优选实施方案中，合成rna分子是人工微rna(mirna)。在一些实施方案中，人工mirna包含嵌入衍生自mir-30、mir-22、mir-15、mir-16、mir-103或mir-107的mirna“骨架”的如本文中所述的有义链和反义链。在一些优选的方面，人工mirna包含嵌入mir-30的如本文中所述的有义链和反义链：cuucagguuaacccaacagaaggcuaaagaagguauauugcuguugacagugagcg(x)n cugugaagccacagauggg(y)nugccuacugccucggacuucaaggggcuacuuuagg(seqid no:46)，其中(x)n和(y)n分别包含来自表1-3任一个的有义链和有义链。

19、在特别优选的方面，人工mirna包含嵌入mir-e的如本文中所述的有义链和反义链：gacuucuuaacccaacagaaggcucgagaagguauauugcuguugacagugagcg(x)nuagugaagccacagaugua(y)nugccuacugccucggacuucaaggggcuagaauuc(seq id no:47)，其中(x)n和(y)n分别包含来自表1-3任一个的有义链和有义链。

20、在一些实施方案中，提供了一种核酸，其包含(i)编码第一抗血管生成多肽(例如阿柏西普)的核苷酸序列，和(ii)编码第二抗血管生成多肽的核苷酸序列。在一些方面，核酸包含表达盒，所述表达盒包含(i)可操作地连接至表达控制序列的编码第一抗血管生成多肽的核苷酸序列，和(ii)可操作地连接至表达控制序列的编码第二抗血管生成多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一抗血管生成多肽的核苷酸序列和编码第二抗血管生成多肽的核苷酸序列可操作地连接至不同的表达控制序列。在优选实施方案中，第一和第二抗血管生成多肽的表达由共同的(即相同的)表达控制序列驱动。在一些方面，表达控制序列包含组成型启动子，诸如cag或cba启动子。在另一些方面，表达控制序列包含细胞特异性启动子。

21、在一些方面，第一和/或第二抗血管生成多肽(即抑制血管生成的多肽)选自内皮抑素、肿瘤抑素、血管抑素、色素上皮衍生因子(pedf)。在一些方面，第一和/或第二抗血管生成多肽是“诱饵”融合蛋白(例如可溶性受体融合蛋白)，其结合vegf(vegf-a(参见例如genbank检索号q16889)、vegf-b(参见例如genbank检索号u48801)、vegf-c(参见例如genbank检索号x94216)、vegf-d(参见例如genbank检索号aj000185)和/或胎盘生长因子(pigf；参见例如genbank检索号x54936))并抑制其活性，“诱饵”融合蛋白的代表性实例包括可溶性vegfr-1(亦称flt-1；参见例如genbank检索号x51602)受体融合蛋白、可溶性vegfr-2(亦称flk-1；参见例如genbank检索号x59397)受体融合蛋白、可溶性vegfr-3(亦称flt-4；参见例如genbank检索号x68203和s66407)受体融合蛋白和包含来自vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3中的至少两种的结合区的嵌合可溶性受体融合蛋白。vegf-a结合vegfr-1和vegfr-2；vegf-b和pigf结合vegfr-2；vegf-c和vegf-d结合vegfr-3。

22、在一些优选的方面，第一抗血管生成多肽是可溶性融合蛋白，其包含任选地与人igg1 fc部分融合的来自vegfr-1和vegfr-2的胞外结构域的vegf结合部分。在特别优选的方面，第一抗血管生成多肽是阿柏西普。阿柏西普是由与人igg1 fc部分融合的来自人vegfr-1和vegfr-2的胞外结构域的vegf结合部分组成的重组融合蛋白。阿柏西普被指示用于治疗新生血管性(湿性)年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿和糖尿病性视网膜病变。

23、在另一些优选的方面，第一和/或第二抗血管生成多肽是包含来自vegfr-3的胞外结构域的一个或多个vegf结合部分的可溶性融合蛋白。

24、在另一些方面，第一和/或第二抗血管生成多肽是结合促血管生成蛋白(诸如vegf和/或血管生成素(血管生成素-1/ang1/ang-1、血管生成素-2/ang2/ang-2))并抑制其活性的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，第一和/或第二抗血管生成多肽是针对ang1和/或ang2的抗体。在另一些方面，第一和/或第二抗血管生成多肽是针对vegf-a(例如贝伐单抗(bevacizumab))、vegf-b、vegf-c、vegf-d、或pigf(例如tb-403、16d3)的抗体，其阻断vegf与其同源受体的结合。在另一些方面，第一和/或第二抗血管生成多肽是针对vegfr-1(例如艾芦库单抗(icrucumab)、d16f7、km1730/km1732)、vegfr-2(例如雷莫芦单抗(ramucirumab))或vegfr-3的抗体，其阻断受体与vegf的结合。在一些方面，抗体是双功能抗体。在一些优选实施方案中，第一和/或第二抗血管生成多肽是与ang-2结合的抗体或其抗原结合片段。

25、在一些实施方案中，核酸包含编码第一抗血管生成多肽的核苷酸序列和编码第二抗血管生成多肽的核苷酸序列，其中第二抗血管生成多肽是色素上皮衍生因子(pedf)。

26、在一些实施方案中，本文中提供了一种载体(例如腺相关病毒(aav)质粒载体)，其包含如本文中所述的核酸(例如包含编码第一和/或第二抗血管生成多肽和/或降低一种或多种促血管生成靶基因的表达的干扰rna分子的核苷酸序列)。在优选实施方案中，载体是重组腺相关(raav)表达载体。在一些实施方案中，raav载体包含天然衣壳(例如aav血清型2或aav血清型5或aav血清型8的衣壳)。在另一些实施方案中，raav载体包含相对于天然aav衣壳经修饰(例如包含一个或多个肽插入和/或一个或多个氨基酸取代(例如酪氨酸至苯丙氨酸)和/或氨基酸插入或氨基酸缺失)的衣壳(例如相对于血清型2、5或8的aav衣壳包含一种或多种修饰)。

27、在优选实施方案中，raav载体包含具有变体衣壳蛋白的衣壳，所述变体衣壳蛋白包含以下氨基酸序列或与其具有至少80％、90％、95％或99％的同一性的序列：maadgylpdwledtlsegirqwwklkpgppppkaaerhkddsrglvlpgykylgpfngldkgepvneadaaalehdkaydrqldsgdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrvleplglveepvktapgkkrpvehspvepdsssgtgkagqqparkrlnfgqtgdadsvpdpqplgqppaapsglgtntmatgsgapmadnnegadgvgnssgnwhcdstwmgdrvittstrtwalptynnhlykqissqsgasndnhyfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqndgtttiannltstvqvftdseyqlpyvlgsahqgclppfpadvfmvpqygyltlnngsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnftfsytfedvpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtntpsgtttqsrlqfsqagasdirdqsrnwlpgpcyrqqrvsktsadnnnseyswtgatkyhlngrdslvnpgpamashkddeekffpqsgvlifgkqgsektnvdiekvmitdeeeirttnpvateqygsvstnlqrgnlaisdqtkharqaatadvntqgvlpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdghfhpsplmggfglkhpppqilikntpvpanpsttfsaakfasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnynksvnvdftvdtngvyseprpigtryltrnl(seq id no:48)

28、seq id no:48的变体aav衣壳蛋白相对于天然aav2衣壳含有以下修饰：(i)在氨基酸位置34处脯氨酸(p)至丙氨酸(a)的突变，其位于组装的衣壳(仅vp1蛋白)内部，和(ii)在氨基酸位置588处10个氨基酸(亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺-苏氨酸-赖氨酸-组氨酸-丙氨酸/laisdqtkha(seq id no:49))的插入，其存在于vp1、vp2和vp3中。在一些实施方案中，衣壳包含变体衣壳蛋白，所述变体衣壳蛋白包含与seq id no:48具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性的序列，并且包含p34a取代和在衣壳的gh环中的laisdqtkha(seq id no:49)肽插入，例如在vp1的氨基酸570和611之间的位置处在两个相邻氨基酸之间，优选在vp1的氨基酸588和589之间(编号相对于天然aav2vp1衣壳)。

29、在另一实施方案中，本文中提供了一种宿主细胞，其包含如本文中所述的核酸。在一些方面，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于cho细胞、hek293细胞、hela细胞、bhk21细胞、vero细胞或v27细胞。在另一些方面，宿主细胞是感光细胞(例如视杆、视锥)、视网膜神经节细胞(rgc)、神经胶质细胞(例如müller神经胶质细胞、小神经胶质细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、或视网膜色素上皮(rpe)细胞。

30、在一些实施方案中，本公开提供了在受试者(例如人受试者)中治疗与眼部血管生成相关的眼部疾病的方法，其包括向受试者施用如本文中所述的核酸分子或载体。