用于固定床反应器的细胞培养取样基材的制作方法

本公开内容大体上涉及实现了基材取样的用于细胞培养的基材，以及具有此类基材的生物反应器。具体来说，本公开内容涉及细胞培养基材以及结合了此类基材且具有端口实现从生物反应器取出样品的生物反应器，从而能够在细胞培养过程期间和/或之后对部分基材进行无菌取样来对培养和其他过程中的健康情况和进展进行监测。

背景技术：

1、在生物加工行业，出于生产激素、酶、抗体、疫苗和细胞疗法的目的进行大规模细胞培养。细胞和基因治疗市场正在快速增长，有希望的治疗进入临床试验并迅速走向商业化。然而，一次细胞治疗剂量可能需要数十亿个细胞或数万亿个病毒。由此，能够在短时间内提供大量细胞产品对于临床成功是至关重要的。

2、生物加工中使用的大部分细胞都依赖于锚点，这意味着细胞需要表面来粘附从而进行生长和发挥功能。传统上，粘附细胞的培养是在二维(2d)细胞粘附表面上进行的，所述细胞粘附表面整合在多种容器形式中的一种，例如：t型瓶、培养皿、细胞工厂、细胞堆叠容器、辊瓶以及容器。这些方案会具有明显缺陷，包括难以实现高到足以使得可用于治疗或细胞的大规模生产的细胞密度。

3、已经建议有替代方法来增加培养细胞的体积密度。这些包括在搅拌罐中进行的微载体培养。在这种方案中，附着到微载体表面的细胞经受恒定剪切应力，导致对增殖和培养性能的明显影响。高密度细胞培养系统的另一个例子是空心纤维生物反应器，其中，当他们在纤维空间之间的空间中增殖时，细胞可以形成大的三维聚集体。然而，由于缺乏营养物，细胞生长和性能受到明显抑制。为了缓解这个问题，将这些生物反应器制造成小的并且不适合大规模生产。

4、用于锚定依赖细胞的高密度培养系统的另一个例子是填装床生物反应器系统。在这种类型的生物反应器中，使用细胞基材来提供粘附细胞的附着表面。介质沿表面或通过半多孔基材灌注，以提供细胞生长所需的营养物和氧气。例如，先前的美国专利第4,833,083号、第5,501,971号以及第5,510,262号已经公开了含有支撑或基质系统的填装床来俘获细胞的填装床生物反应器系统。填装床基质通常是由多孔颗粒作为基材或者聚合物的非织造微纤维来制造得到的。此类生物反应器起到了再循环流通式生物反应器的功能。明显问题之一在于，此类生物反应器在填装床内的细胞分布不是均匀的。例如，填装床起到了深度过滤器的功能，细胞主要俘获在入口区域处，导致接种步骤期间的细胞分布的梯度。此外，由于无规纤维填装，填装床的横截面的流动阻力以及细胞俘获效率不是均匀的。例如，介质快速流动通过具有低的细胞填装密度的区域，而缓慢流动通过由于较高数量的俘获细胞导致较高阻力的区域。这产生了通道效应，其中，营养物和氧气被更有效地传递到具有较低体积细胞密度的区域，而具有较高细胞密度的区域则维持在非最优培养条件下。

5、现有技术公开的填装床系统的另一个明显缺陷在于，无法在培养过程结束时高效地收获完整的活细胞。如果最终产品是细胞或者如果生物反应器被用作“接种序列”的一部分(其中，细胞群体在一个容器中生长，然后转移到另一个容器以使得群体进一步生长)的话，那么细胞的收获是至关重要的。美国专利第9,273,278号公开了改善细胞收获步骤期间从填装床回收细胞的效率得到改善的生物反应器设计。其基于疏松填装床基质以及填装床颗粒的振动或搅拌来实现多孔基质碰撞并由此分离细胞。然而，这种方案是费力的，并且可能导致明显细胞破坏，从而降低了整体细胞存活率。

6、目前市场上的填装床生物反应器的例子是pall有限公司生产的icellis使用由以非织造布置的无规取向纤维构成的细胞基材材料的小条。将这些条填装到容器中以产生填装床。然而，如同市场上类似的解决方案那样，这种类型的填装床基材存在缺陷。具体来说，基材条的非均匀填装产生了填装床内视觉可见的通道，导致优先和非均匀的介质流动以及填装床的营养物分布。对的研究已经注意到“细胞的系统性非均质分布，它们的数量从固定床的顶部到底部发生增加”以及“营养物梯度……导致限制了细胞生长和生产”，这全都导致“可能影响转染效率的细胞的不均分布”。(rationalplasmid design and bioprocess optimization to enhance recombinant adeno-associated virus(aav)productivity in mammalian cells(合理的质粒设计和生物过程优化，以提高哺乳动物细胞中重组腺相关病毒(aav)的生产力)，生物技术期刊，2016年11月，290-297页)。研究注意到填装床的搅拌可以改善分布，但是会具有其他缺陷(即，“在接种和转染过程中为了更好地分散而进行的必要搅拌会诱发剪切应力的增加，这进而导致细胞活力降低”，同上)。的另一项研究注意到：细胞的不均匀分布使得使用生物量传感器监测细胞群体是困难的(“……如果细胞分布不均匀，则顶部载体上细胞的生物量信号可能无法显示整个生物反应器的全貌”。process development of adenoviral vectorproduction in fixed bed bioreactor:from bench to commercial scale(固定床生物反应器中腺病毒载体生产的工艺开发：从实验室到商业规模)，人类基因治疗，第26卷，第8期，2015年)。

7、此外，由于纤维在基材条中的无规排布以及的一个填装床与另一个之间的条填装中的变化，消费者可能难以预测细胞培养性能，因为培养之间的基材是不同的。此外，的填装基材非常难以或不可能高效地收获细胞，因为相信细胞被填装床所俘获。

8、虽然利用现有平台可以制造用于早期临床试验的病毒载体，但是需要能够以更大数量生产高质量产品的平台，以达到后期商业制造规模。

9、此外，希望能够对用于细胞培养或者制造aav或者产生接种序列的生物反应器进行监测从而有助于生物化学生产的细胞扩增。当采用贴附细胞反应器时，生长介质的样品不含细胞，或者至少对于用于贴附基材上的培养状态监测而言没有到达可用的程度。

10、存在对于这样的细胞培养基质、系统和方法的需求，它们能够实现高密度形式的细胞培养，具有均匀的细胞分布，并且易于获得和具有增加的收获产率，同时还允许用户在细胞培养过程期间和/或之后对基材上的细胞进行检查(包括对基材进行无菌监测)来对细胞培养过程的状态进行监测。

技术实现思路

1、根据本公开内容的实施方式，公开的细胞培养基材实现了对整个基材或者一部分的基材进行取样来对细胞培养的状态或者健康程度进行监测。实施方式包括多层固定床细胞培养基质，其具有经过特殊设计的一层或多层来实现这种取样。实施方式还包括具有此类细胞培养基材和/或基质的固定床生物反应器。

2、为了能够对贴附细胞生物反应器床中的细胞数量和它们的分布以及健康情况进行估算，一种方法采用在细胞培养或者细胞扩增过程的中段取出一部分的基材。通过在过程期间进行取样，可以将关于细胞培养运行的信息用于评估过程的质量和表现。可以从样品对细胞计数进行估算，以及可以通过不同时间的取样来对生长进行监测。这个信息可以被用于对具体生物过程(例如接种序列和病毒载体生产)进行开发和优化表现。在生产中，受到污染或者不符合规格的运行会被终止，从而降低在没有令人满意的结果的情况下运行该过程到最后的成本。对于典型生物过程，生长介质和损失的生产时间代表了明显的成本。本公开内容的实施方式实现了从外壳取出整个或者部分的固定床细胞培养基材，从而使得用户在没有破坏床或生物反应器容器的情况下对于床具有可及性。这实现了对任意部分或者选定部分的固定床进行评估。还可以在细胞培养过程之后或者在完成所需组分的收获之后到达床，用于细胞培养的“事后”分析。

3、根据本公开内容的实施方式，提供了用于细胞培养的填装床生物反应器系统。该系统包括：细胞培养容器，其具有至少一个内部储器，流体连接到储器的入口，和流体连接到储器的出口；以及布置在储器中的填装床细胞培养基质。细胞培养基质包括多个结构受限定的基材层，用于使得细胞贴附到其，并且每层基材层具有规则且均匀的物理结构和孔隙度。实施方式的一些方面包括具有均匀孔隙度的填装床细胞培养基质和/或构造成使得均匀流体流动通过其的填装床细胞培养基质。作为另一个方面，所述多个结构受限定的基材包括布置在储器中的基材碟的堆叠。在另一个方面中，结构受限定的基材包括限定了孔隙度的多个开口，所述多个开口以规则或均匀式样排布在每个基材碟中。

4、根据本公开内容的实施方式，提供了细胞培养基质。细胞培养基质包括基材，其具有第一侧，与第一侧相反的第二侧，将第一侧与第二侧分开的厚度，以及形成在基材中且穿过基材厚度的多个开口。所述多个开口构造成允许细胞培养介质、细胞或者细胞产物中的至少一种流动穿过基材厚度。基材可以是以下至少一种：模制聚合物栅格片(latticesheet)、3d打印栅格片和织造网片。基材具有规则有序结构并且提供了用于细胞贴附、生长和最终的细胞释放的表面。

5、根据本公开内容的实施方式，提供了用于细胞培养的生物反应器系统，该系统包括：具有至少一个储器的细胞培养容器；以及布置在所述至少一个储器中的细胞培养基质，细胞培养基质包括织造基材，其具有表面构造成使得细胞贴附到其的多根交织纤维。

6、根据一个或多个实施方式，提供了细胞培养系统，该系统包括：生物反应器容器；以及布置在生物反应器容器中且构造成培养细胞的细胞培养基质。细胞培养基质包括基材，其包含：第一侧，与第一侧相反的第二侧，将第一侧与第二侧分开的厚度，以及形成在基材中且穿过基材厚度的多个开口，并且所述多个开口构造成允许细胞培养介质、细胞或者细胞产物中的至少一种流动穿过基材厚度。

7、根据一个或多个实施方式，提供了用于细胞培养的生物反应器系统。该系统包括：具有第一端、第二端和位于第一与第二端之间的至少一个储器的细胞培养容器；以及布置在所述至少一个储器中的细胞培养基质。细胞培养基质具有多个织造基材，每个包括表面构造成使得细胞贴附到其的多根交织纤维。生物反应器系统构造成以从第一端到第二端的流动方向使得材料流动通过所述至少一个储器，以及所述多个织造基材中的基材堆叠成使得每个织造基材基本平行于其他每一个织造基材并且基本垂直于流动方向。

8、根据一个或多个实施方式，提供了用于细胞培养的生物反应器系统。该系统包括：具有第一端、第二端和位于第一与第二端之间至少一个储器的细胞培养容器；以及布置在所述至少一个储器中的细胞培养基质，细胞培养基质包括多个织造基材，每个具有表面构造成使得细胞贴附到其的多根交织纤维。生物反应器系统构造成以从第一端到第二端的流动方向使得材料流动通过所述至少一个储器，以及所述多个织造基材中的基材堆叠成使得每个织造基材基本平行于其他每一个织造基材并且基本平行于流动方向。

9、根据一个或多个实施方式，提供了用于细胞培养的生物反应器系统。该系统包括：具有第一端、第二端和位于第一与第二端之间的至少一个储器的细胞培养容器；以及布置在所述至少一个储器中的细胞培养基质。细胞培养基质包括织造基材，其包括具有构造成使得细胞粘附到其的表面的多根交织纤维，并且织造基材以卷绕构造布置在所述至少一个储器中从而提供圆柱形细胞培养基质，织造基材的表面平行于圆柱形细胞培养基质的纵轴。

10、根据另一个实施方式，提供了生物反应器中的细胞培养方法。该方法包括提供生物反应器容器，其具有生物反应器容器内的细胞培养室以及布置在细胞培养室中的细胞培养基质。提供细胞培养基质使得在其上培养细胞。细胞培养基质包括基材，其具有第一侧，与第一侧相反的第二侧，将第一侧与第二侧分开的厚度，以及形成在基材中且穿过基材厚度的多个开口。该方法还包括在细胞培养基质上接种细胞；在细胞培养基质上培养细胞；以及收获细胞培养的产物。基材中的所述多个开口允许细胞培养介质、细胞或者细胞产物中的至少一种流动穿过基材厚度。