作为新型基因沉默技术的非对称短双链体DNA及其应用的制作方法

本发明涉及作为基因沉默技术的非对称短双链体dna，及其相关的组合物和方法，可用于生物或医学研究、疾病的治疗和预防、以及在其它生物领域中的基因沉默应用。

背景技术：

1、现代医学疗法依赖于两项基本的技术，即小分子化学成分和蛋白质/抗体技术。然而，仅有约10％的被基因组学研究和生物医学研究所确定的靶点可以通过上述两项基础技术解决。寡核苷酸有望解决众多的靶点，包括通过小分子化学成分和蛋白质/抗体技术不可成药的靶点。经过40多年的研究创造了反义寡核苷酸(aso，antisense oligonucleotide)和小干扰rna(sirna，small interfering rna)技术(cy a.stein et al.,2017)。然而，尽管经过40多年的研究，除少数临床孤儿适应症外，显著的成药性问题阻碍了aso和sirna技术成为主流治疗平台的发展。这些成药性问题包括，除其他外：低沉默效率，脱靶效应，刺激非预期免疫反应，组织渗透性挑战和体内递送等。因此，在各种生物和医学应用中，创造新技术以靶向感兴趣的基因存在着显著未满足的需求。

2、aso是一种基因沉默技术，其基于最初于1978年提出的概念(zamecnik p.c.etal.,1978)。一般来说，aso技术背后的原理是反义寡核苷酸与靶标核酸杂交，调节基因表达的活性或功能，例如转录/转录后或翻译。其机制大体上分为：(1)仅占位而不促进rna的降解，其中aso的结合导致翻译停滞(translational arrest)，剪接抑制或诱导可变剪接变体，或者(2)占位诱导的不稳定(occupancy-induced destabilization)，其中aso的结合促进通过内源性酶降解rna，例如核糖核酸酶h1(rnase h1)；和(3)翻译调节：aso可阻断在5’utr区域的上游开放阅读框(uorfs)或者其它抑制性或调控性元件，提高或调节翻译效率(stanley t.crooke et al.,2008；c.frank bennett,2010；richard g.lee,2013；stanleyt.crooke,2017)。aso是单链脱氧核糖核苷酸序列的结构，可以通过碱基配对与靶标rna结合。经过40年的研究，通过各种对单链寡核苷酸的化学修饰使得aso技术得到了改进，例如硫代磷酸酯取代或其它经修饰的核苷酸(参见iwamoto n et al 2017,crooke st,2017；crooke st et al.,2018；u.s.pat.nos.7919472和9045754)。

3、短双链rna通过rnai机制触发同源序列rna丢失，这种机制首次在植物中观察到，并在线虫(秀丽隐杆线虫)中得到证实(a.fire et al,1998)。该机制涉及长dsrna降解为短干扰双链体rna(sirna)，sirna与多蛋白rna诱导沉默复合物(rics，rna-inducedsilencing complex)相互作用；在risc中，sirna是解旋的，其中的有义链丢弃，反义链或者引导链与risc核酸内切酶ago2结合，随后ago2裂解靶标rna(de fougerolles et al.,2007；ryszard kole,2016)。在哺乳动物细胞中，合成的sirna或非对称短干扰rnas(airna或非对称sirna)可以通过依赖risc的机制用于诱导基因沉默(参见elbashir sm et al.,2001；sun x et al.,2008；u.s.pat.nos.7056704和9328345)。

4、已研究几十年的寡核苷酸，其被认为很有望成为一类全新的疗法。然而其有限的沉默效率，递送挑战和剂量依赖性副作用(包括杂交依赖性毒性和杂交非依赖性毒性)一直限制着这些新型疗法的发展(c.frank bennett,2010；c.frank bennett,2019；roberts tcet al.,2020；crooke st et al.,2018；和setten rl et al.,2020)。一般来说，虽然aso化合物在诱导基因沉默中的效能不及基于sirna的化合物，但是aso化合物与sirna化合物相比，其具有一些药学上的优势。目前，aso和sirna仍然是设计基因沉默治疗疗法的两种同等重要的平台技术(crooke st et al 2018；roberts tc et al 2020)。寡核苷酸的杂交依赖性毒性主要归于其与非靶标基因的杂交(“脱靶效应”)(jackson et al.,2003；lin x etal.,2005)。寡核苷酸的非杂交依赖性毒性是通过其与蛋白质的相互作用发生：这些作用包括增加凝血时间，促炎作用和激活补体途径。这些作用倾向于发生在较高剂量的寡核苷酸中，并且是剂量依赖性的。例如，在较高浓度下，aso可导致肾小管病变和血小板减少(geary,rs.et al.,2007；kwoh jt,2008)。临床上，第一代ps反义寡脱氧核苷酸和第二代经2’-moe修饰的反义寡核苷酸的主要耐受性和安全性问题已被证明是非杂交依赖的作用，如延长活化部分凝血活酶的时间、注射部位反应和诸如发热、发冷和头痛的全身症状(c.frank bennett,2010；henry s p,2008；kwoh j t,2008)。即使是最优化的aso通常也仍然远不及sirna有效，而且其被证明具有剂量依赖性的典型毒性(kendall s.frazier,2015)。在过去的40年里，为减轻寡核苷酸的剂量依赖性毒性，人们一直努力通过各种化学修饰来克服aso有限的效能问题和相关的安全性问题(iwamoto n et al 2017,crooke stet al.,2018；和roberts tc et al.,2020)。

5、与aso相比，sirna双链体的脱靶效应被认为是由有义链介导的沉默，与内源性mirna通路的竞争，以及与tlr或其它蛋白质的相互作用所介导的(setten rl et al2019)。另外，典型的21nt/19bp sirna双链体在细胞和组织渗透力方面效率不高，也需要广泛的化学修饰以增强sirna的稳定性和其它药物性质。为克服由对称sirna的有义链介导的脱靶效应和其它脱靶机制，设计了非对称sirna(或者airna)(参见sun x et al.,2008；grimm d,2009；selbly cr et al.,2010；和pct专利wo2009029688)。

6、总之，经过40多年的aso技术创新和20多年的基于rnai技术研究后，成功开发针对近90％与人类疾病相关的靶点的基因靶向疗法仍然具有挑战性。此外，针对现在已批准的寡核苷酸药物，每位患者每年的花费超过50万美元，因此无法解决影响普通人群的疾病。因此，迫切需要新的技术来克服这些挑战。

7、本文引用的参考文献不视为承认是请求保护的本发明的现有技术。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明基于由非对称短双链体脱氧核糖核苷酸(asddna，asymmetric shortduplex deoxyribonucleotides，非对称sddna)触发的有效的基因沉默的出人意料的发现。这种新型基因沉默技术由asddna实现，asddna采用了一种由连接着的核苷酸单体组成的短的双链体分子，并具有一个或更多个间隔的核糖核苷酸，其中每个核苷酸单体选自下组：天然存在的核苷酸、其类似物(analog)和经修饰的核苷酸(以下统称为“核苷酸单体”)。换句话说，本发明的一个实施方案中使用的核苷酸单体包含“脱氧核糖核苷酸单体”，其中“脱氧核糖核苷酸单体”选自下组：天然存在的脱氧核糖核苷酸、其类似物和经修饰的脱氧核糖核苷酸。进一步的，通过掺入一个或几个间隔的核糖核苷酸单体，可以显著实现或增强asddna的基因沉默功能。“核糖核苷酸单体”可选自下组：天然存在的核糖核苷酸、其类似物和经修饰的核糖核苷酸。

2、在本发明中，短双链体dna(sddna)分子，或者更具体地，非对称短双链体dna(asddna)分子进一步地被核糖核苷酸单体间隔开，形成至少一个核糖核苷酸单体的间隔片段(isr，interspersed segment of ribonucleotide monomer(s))。

3、在一个实施例中，本公开所包含的基于asddna的新型平台技术的强大基因沉默效应是通过寡核苷酸单体有义链和寡核苷酸单体反义链实现的，其中寡核苷酸单体反义链与靶标核糖核苷酸序列基本上互补。我们的数据显示本技术的asddna分子因其独特、新颖的组成，可以在皮摩尔浓度下引起基因沉默，比现有的反义(aso)技术和sirna技术效能更强，因此可以减少剂量依赖性毒性。本技术的asddna分子还有望具有优于现有基因沉默技术的至少一个以下优势，包括更好的组织渗透力；相比于基于sirna的基因沉默仅发生在细胞质中，asddna可以在细胞核、线粒体等中实现基因沉默；减少脱靶效应；更好的稳定性；消除或减少与sirnas相关的与内源性microrna途径不期望的竞争；低合成成本以及改进的药学性质。因此，本发明的asddna分子对解决aso、sirna和其它现有基因沉默技术面临的各种挑战方面具有巨大的潜能。本发明的asddna分子可以用于当前寡核苷酸所正在应用或预期使用的全部领域，包括研究、诊断、疾病预防和治疗以及生物领域的其它应用，还包括农药和兽药领域。

4、第一方面，本发明提供一种组合物，其包含短双链体dna(sddna)分子，其中sddna分子具有比第二链长的第一链。换句话说，该sddna分子是非对称短双链体dna(asddna)分子，其中asddna分子的第二链比第一链短。由于第一链通过至少一个靶向区与靶标rna的靶标片段基本上互补，因此第一链可以被认为是反义链或者反义寡核苷酸。进一步地，第二链与第一链基本上互补，与第一链形成至少一个双链区，第二链也可以被视为是有义链或者有义寡核苷酸。asddna分子包含至少一个核糖核苷酸单体间隔片段(isr)。在一个特征中，asddna分子中的isr包含至少一个核糖核苷酸单体，其中isr可以存在于任一条链中或者在两条链中均存在。

5、本发明提供的组合物用于调节真核细胞中的基因表达或功能，其中asddna与细胞接触或者向受试者施用。

6、在一些实施方案中，asddna分子包含至少一个或至少两个核糖核苷酸单体间隔片段(isr)。在一个特征中，本发明的asddna分子的第一链包含至少一个isr。在一个实施方案中，第一链包含至少一个isr并且第二链也包含至少一个isr。在一个特征中，每个isr各自独立地由一个核糖核苷酸单体组成，或包含至少2、3、4或5个连续的核糖核苷酸单体。在另一个特征中，isr包含至少2个核糖核苷酸单体，其中该核糖核苷酸单体是连续的或其被至少一个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)不同种类的单体掺入而隔开。在另一个特征中，第一链中所有isr的核糖核苷酸单体总数至少为2。

7、在一个特征中，至少一个isr分布在第一链(反义链)的至少一个靶向区中。在另一个特征中，至少一个isr分布在第二链(有义链)的至少一个双链区中。在另一个特征中，至少一个isr分布在第一链(反义链)的至少一个靶向区中且至少一个isr分布在第二链(有义链)的至少一个双链区中。在一些实施方案中，至少一个isr可以分布在第一链的任意位点。在一些实施方案中，至少一个isr位于第一链的5’端或者靠近第一链的5’端(从所述链末端起数的7个核碱基以内，或者从所述链末端起数的核碱基总数的33％个以内，例如：长度约为21个核碱基的链，从所述末端起数的第1、2、3、4、5、6或7个核碱基位置)；和/或至少一个isr位于第一链的3’端或者靠近第一链的3’端(从所述链末端起数的7个核碱基以内，或者从所述链末端起数的核碱基总数的33％个以内)；和/或至少一个isr位于第一链的更中心位点。在一些实施方案中，第一链中分布的至少一个isr仅位于第一链的突出区域。在一些实施方案中，第一链中分布的至少一个isr位于第一链的突出区域和双链区。在一些实施方案中，第一链中的isr包含至少一个位于第一链的5’端或3’端的核糖核苷酸单体。在一些实施方案中，至少一个isr位于第二链的5’端或者靠近第二链的5’端(从所述链末端起数的7个核碱基以内，或者从所述链末端起数的核碱基总数的33％个以内)；和/或至少一个isr位于第二链的3’端或者靠近第二链的3’端(从所述链末端起数的7个核碱基以内，或者从所述链末端起数的核碱基总数的33％个以内)；和/或至少一个isr位于第二链的更中心位点。

8、在一个特征中，第一链或反义链包含多个连接着的核苷酸单体以形成核碱基序列，并且第一链或反义链至少70％、80％、85％、90％、95％或者完全地与靶标基因的rna的靶标片段互补。在某些实施方案中，靶标rna选自mrna或非编码的rna，其中rna或者编码与疾病有关的蛋白质或者调控与疾病有关的部分生物学通路，例如哺乳动物疾病。术语“靶标(target)”和“靶标的(targeted)”在本公开中可互换地使用并具有相同的含义。

9、在各种实施方案中，第一链/反义链具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个连接着的核苷酸单体的主链长度，或其等值长度，或由上述任意两数值括起来的长度范围(范围的两个端点值均包括在其中)。例如，第一链的一些长度范围包括：(a)8-33个核苷酸单体，(b)10-30个核苷酸单体，(c)10-29个核苷酸单体，(d)12-29个核苷酸单体，(e)12-28个核苷酸单体，(f)12-26个核苷酸单体，(g)12-25个核苷酸单体，(h)13-25个核苷酸单体，(i)13-24个核苷酸单体，(j)13-23个核苷酸单体，(k)15-23个核苷酸单体，(l)8-50个核苷酸单体，(m)10-36个核苷酸单体，(n)12-36个核苷酸单体，(o)12-32个核苷酸单体，(p)14-36个核苷酸单体，和(q)至少8个核苷酸单体。

10、在一个特征中，第二链或有义链包含多个连接着的核苷酸单体以形成核碱基序列，并且第二链或有义链至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或者完全地与第一链或反义链的至少一个连接着的区域互补。在一些实施方案中，有义链完全地与第一链或反义链的至少一个连接着的区域互补，且形成至少一个没有任何错配的双链区。在一些实施方案中，有义链与第一链或反义链的至少一个连接着的区域互补，且形成至少一个具有1、2、3或者更多个错配的双链区。在一个特征中，有义链中的错配单体具有的核碱基选自由a、g、c和t组成的群组或选自经修饰的核碱基。在一些实施方案中，第二链的第一个碱基和最后一个碱基中的至少一个与第一链中的碱基互补。在一些实施方案中，至少第二链的第一个碱基和最后一个碱基与第一链中的核碱基互补。

11、在一个特征中，第二链或有义链具有的主链长度比第一链或反义链的短至少以下数量个的核苷酸单体：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38。在各种实施方案中，第二链或有义链具有的主链长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连接着的核苷酸单体，或其等值长度，或由上述任意两数值括起来的长度范围(范围的两个端点值均包括在其中)。例如，在某些实施方案中，第二链的一些长度范围包括：(a)8-32个核苷酸单体，(b)8-30个核苷酸单体，(c)8-29个核苷酸单体，(d)9-29个核苷酸单体，(e)9-26个核苷酸单体，(f)9-25个核苷酸单体，(g)10-29个核苷酸单体，(h)10-28个核苷酸单体，(i)10-26个核苷酸单体，(j)10-25个核苷酸单体，(k)11-24个核苷酸单体，(l)12-23个核苷酸单体，(m)12-23个核苷酸单体，(n)12-22个核苷酸单体，(o)13-23个核苷酸单体，(p)15-23个核苷酸单体，(q)8-35个核苷酸单体，(r)8-33个核苷酸单体，(s)9-35个核苷酸单体，(t)9-34个核苷酸单体，(u)9-32个核苷酸单体，(v)9-30个核苷酸单体，(w)10-30个核苷酸单体，(x)10-32个核苷酸单体，(y)至少8个核苷酸单体和(z)至少6个核苷酸单体。在某些实施方案中，在第二链能够与第一链形成热力学稳定的双链体情况下，第二链的主链长度可以具有小于第一链长度的任何数量的核苷酸单体。

12、在一个特征中，第一链的两个末端是以下配置中的一种：3’突出端和5’突出端，3’突出端和5’端平末端，5’突出端和3’端平末端，3’突出端和5’凹陷端或5’突出端和3’凹陷端。在某些实施方案中，第一链的3’突出端具有的长度为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸单体，或由上述任意两数值括起来的范围(范围的两个端点值均包括在其中)。在各种实施方案中，第一链的3’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。

13、在某些实施方案中，第一链的5’突出端具有的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸单体，或由上述任意两数值括起来的范围(范围的两个端点值均包括在其中)。在各种实施方案中，第一链的5’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。

14、在本发明的一个实施方案中，第一链具有1-15个核苷酸单体的3’突出端和1-15个核苷酸单体的5’突出端。在另一个实施方案中，第一链具有1-26个核苷酸单体的3’突出端和5’平末端或者5’凹陷端。在另一个实施方案中，第一链具有1-26个核苷酸单体的5’突出端和3’平末端或者3’凹陷端。

15、在一个特征中，第二链的两个末端是以下配置中的一种：3’突出端和5’凹陷端，5’突出端和3’凹陷端，3’端平末端和5’凹陷端，5’平末端和3’凹陷端，3’凹陷端和5’凹陷端。在某些实施方案中，第二链的3’突出端具有的长度为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸单体。在各种实施方案中，第二链的3’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。在某些实施方案中，第二链的5’突出端具有的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸单体。在各种实施方案中，第二链的5’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。

16、在本发明asddna分子的一个特征中，第一链和/或第二链中至少一个核苷酸单体是经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，例如，糖经修饰的，主链经修饰的，和/或碱基经修饰的核苷酸。在一个实施方案中，主链经修饰的核苷酸至少在核苷间键中具有修饰，例如包括氮杂原子或硫杂原子中的至少一个。在某些实施方案中，经修饰的核苷间键是或包含：硫代磷酸酯基团(p＝s)、磷酸三酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。

17、在某些实施方案中，第一链和/或第二链包含至少一个经修饰的核苷间键，其中经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，第一链和/或第二链的每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在各种实施方案中，第一链和/或第二链的核苷间键是硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合。

18、在一个特征中，本发明分子的第一链和/或第二链包括至少一个的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，其中经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含经修饰的糖部分。在某个实施方案中，经修饰的糖部分的2’位被选自由下列的基团所取代：or、r、卤基、sh、sr、nh2、nhr、nr2或cn，其中每个r独立地是c1-c6烷基、烯基或炔基，卤基是f、cl、br或i。在一些实施方案中，经修饰的糖部分的2’位被选由下列的基团取代：烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、o-烯丙基、o-c1-c10烷基、ocf3、och2f、o(ch2)2sch3、o(ch2)2-o-n(rm)(rn)、o-ch2-c(＝o)-n(rm)(rn)、或o-ch2-c(＝o)-n(r1)-(ch2)2-n(rm)(rn)，其中每个r1，rm和rn独立地是h或取代或未取代的c1-c10烷基。在一些实施方案中，经修饰的糖部分具有选自下组的取代基团：5’-乙烯基，5’甲基(r或s)，4’-s、2’-f、2’-och3、2’-och2ch3、2’-och2ch2f、2'-o-氨基丙基化(2’-ap)，和2’-o(ch2)2och3。在一些实施方案中，经修饰的糖部分被选自由下组的双环糖取代：4′-(ch2)—o-2′(lna)、4′-(ch2)—s-2′、4′-(ch2)2—o-2′(ena)、4′-ch(ch3)—o-2′(cet)和4′-ch(ch2och3)—o-2′、4′-c(ch3)(ch3)—o-2′、4′-ch2—n(och3)-2′、4′-ch2—o—n(ch3)-2′、4′-ch2—n(r)—o-2′(其中r是h，c1-c12烷基或保护基团)，4′-ch2—c(h)(ch3)-2′、和4′-ch2—c—(═ch2)-2′。在一些实施方案中，经修饰的糖部分选自下组：2’-o-甲氧基乙基经修饰的糖(moe)、4′-(ch2)—o-2′双环糖(lna)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖(2’-f阿拉伯糖，fana)和甲基(亚甲氧基)(4′-ch(ch3)—o-2双环糖(cet)。

19、在本发明asddna分子的一个特征中，脱氧核糖核苷酸单体的糖部分是天然存在的脱氧核糖核苷酸的糖部分(2-h)或2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖(fa)。

20、在本发明asddna分子的一个特征中，核糖核苷酸单体的糖部分选自：天然存在的核糖核苷酸(2-oh)、2’-f修饰的糖、2’-ome修饰的糖、2’-o-甲氧基乙基修饰的糖(moe)、4′-(ch2)—o-2′双环糖(lna)和甲基(亚甲氧基)(4′-ch(ch3)—o-2双环糖(cet)。

21、在一个特征中，本发明分子的第一链和/或第二链包括至少一个核苷酸单体，其中核苷酸单体包含经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基选自下组：5-甲基胞嘧啶(5-me-c)，次黄嘌呤核苷碱基，三苯甲基化碱基，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基(-c≡c-ch3)尿嘧啶以及胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，1-甲基-假尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基以及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴代)、5-三氟甲基、5-甲基尿苷以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-f-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。在特定实施方案中，经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在一个实施方案中，本发明分子的每个胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶。在一个实施方案中，本发明asddna分子的isr中每个尿苷碱基是5-甲基尿苷。

22、在一个特征中，现发明的asddna可能包含至少一个cpg基序，其中cpg基序可以被例如toll样受体的模式识别受体(prr)所识别。

23、在一个特征中，本发明分子的第一链和/或第二链与配体或部分相缀合。在某个实施方案中，配体或部分选自下组：多肽、抗体、多聚物、多糖、脂质、疏水部分或分子、阳离子部分或分子、亲脂性化合物或部分、寡核苷酸、胆固醇、galnac和核酸适体。

24、在本发明的一个特征中，asddna分子用于调节细胞(例如真核细胞，如哺乳动物细胞)中的基因表达或功能。

25、在某些实施方案中，靶标rna，根据本发明原理决定了asddna分子的至少部分核苷酸单体序列，选自mrna或非编码rna，其中这些rna或者编码与疾病有关的蛋白质或者调控与疾病有关的部分生物学通路。在各种实施方案中，这种靶标rna可选自：与人类或动物的疾病或病症有关的基因的mrna；致病微生物的基因的mrna；病毒rna，和与选自由自身免疫性疾病、炎症性疾病、退行性疾病、传染性疾病、增殖性疾病、代谢性疾病、免疫介导的紊乱、过敏性疾病、皮肤病、恶性病、胃肠道疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病、肾脏疾病、类风湿性疾病、神经系统疾病、内分泌紊乱，和衰老相关疾病或紊乱组成的组的疾病或紊乱有关的rna。

26、在一个实施方案中，本发明提供一种非对称短双链体dna(asddna)分子，其包含第一链和第二链，每条链包含连接的核苷酸单体，其中核苷酸单体选自下组：核苷酸、其类似物和经修饰的核苷酸，其中：(a)第一链比第二链长至少选自下组数量的单体：1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个；(b)第一链通过至少一个靶向区与靶标rna的靶标片段基本上互补，其中第一链由10-36个(范围的两个端点均包括在其中)通过键连接着的核苷单体组成，其中键选自由相邻单体间的硫代磷酸酯键，磷酸二酯键，和硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合组成的组；(c)第二链与第一链基本上互补，与第一链形成至少一个双链区，其中第二链由8-32个(范围的两个端点均包括在其中)通过键连接着的核苷单体组成，其中键选自由相邻单体间的硫代磷酸酯键，磷酸二酯键，和硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合组成的组；(d)asddna分子包含至少一个核糖核苷酸单体间隔片段(isr)与至少一个脱氧核糖核苷酸单体相连，其中脱氧核糖核苷酸单体选自由脱氧核糖核苷酸，其类似物和经修饰的脱氧核糖核苷酸组成的组；(e)asddna分子的isr包含至少一个核糖核苷酸单体，其中核糖核苷酸单体选自由核糖核苷酸，其类似物和经修饰的核糖核苷酸组成的组。在一个特征中，asddna分子用于调节细胞(例如真核细胞，如哺乳动物细胞)中的靶标基因表达或功能。在另一个特征中，asddna分子在细胞中使靶标基因表达的沉默作用比对应的aso更强或更有效。

27、第二方面，本发明提供了一种药物组合物，包含作为活性剂的第一方面的组合物，和其药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。此类载体的实例包括，但不限于：药物载体、正电荷载体、脂质体、脂质纳米颗粒、蛋白质载体、疏水部分或分子、阳离子部分或分子、galnac、多糖聚合物、纳米颗粒、纳米乳剂、胆固醇、脂质、亲脂性化合物或部分、以及类脂。

28、第三方面，本发明提供了一种使用第一方面的组合物或第二方面的药物组合物以治疗或预防疾病或病症的方法，通过施用治疗有效量的本发明的asddna分子或包含该asddna分子的药物组合物。施用方法选自以下途径：静脉注射(iv)、皮下注射(sc)、口服(po)、肌肉注射(im)、经口施用、吸入、局部、鞘内和其它部位的施用方式。

29、在一个特征中，被预防性或治疗性治疗的疾病或病症选自下组：癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、退行性疾病、传染性疾病、增殖性疾病、代谢性疾病、免疫介导的紊乱、过敏性疾病、皮肤病、恶性病、胃肠道疾病、肝脏疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病、皮肤病、肾脏疾病、类风湿疾病、神经系统疾病、精神疾病、内分泌紊乱和与衰老相关疾病或紊乱。

30、第四方面，本发明提供了一种使用第一方面的组合物或第二方面的药物组合物以调控或调节真核细胞中的基因表达或基因功能的方法。该方法包括以下步骤：使细胞与有效量的本发明的任一asddna分子或包含该asddna分子的药物组合物接触。

31、在一个实施方案中，所述接触步骤包括以下步骤：将包含所述asddna分子的组合物引入可以发生选择性基因沉默的培养中的靶细胞或生物体中。在进一步的实施方案中，引入步骤是选自由以下组成的组：简单混合、转染、脂质转染、电穿孔、感染、注射、经口施用、静脉注射(iv)、皮下注射(sc)、口服(po)、肌肉内(im)注射、吸入、局部、鞘内和和其它部位的施用方式。在另一个实施方案中，引入步骤包含使用药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，其中药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂选自下组：包括药物载体、正电荷载体、脂质纳米颗粒、脂质体、蛋白质载体、疏水部分或分子、阳离子部分或分子、galnac、多糖聚合物、纳米颗粒、纳米乳剂、胆固醇、脂质、亲脂性化合物或部分、以及类脂。

32、在某些实施方案中，靶标基因是mrna。在某些实施方案中，靶标基因是例如microrna和incrna的非编码rna。

33、在一个实施方案中，靶标基因与哺乳动物的疾病、病理状况或不良状况相关。在进一步的实施方案中，靶标基因是病原微生物的基因。在更进一步的实施方案中，靶标基因是病毒基因。在另一个实施方案中，靶标基因是肿瘤相关基因。在又一个实施方案中，靶基因是与选自在第三方面列出的疾病群组相关的基因。

34、在另一方面，本发明提供的一种非对称寡聚双链体包含(a)一个或多个脱氧核糖核苷、其类似物或经修饰的脱氧核糖核苷，和(b)一个或多个isr连接到至少8个核碱基长度的反义序列中，其中isr包含核糖核苷，其类似物或经修饰的核糖核苷。反义序列至少70％与靶序列互补。

35、根据本文提供的附加描述(包括不同的实施例)，本发明的其它特征和优点是显而易见的。所提供的实施例示出了在实施本发明时有用的不同组分和方法。实施例不限制所要求保护的发明。根据本公开的内容，本领域的技术人员可以确认和采用对实施本发明有用的其它组分和方法。已经显示和描述了几个实施方案，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行任何修改。