用于乙醇生产的酵母菌株的开发的制作方法

本公开涉及酵母菌株及其衍生物，以及包含用于乙醇生产的酵母菌株的组合物。本公开还涉及使用酵母菌株和组合物从生物质生产乙醇的方法。特别是，酵母菌株比目前用于乙醇生产过程的菌株和产品产生更低的甘油和更高的乙醇，并且具有更高的温度和有机酸耐受性以及更高的发酵速率。

背景技术：

1、乙醇可以使用生物有机体固有的不同生化途径从生物体中产生。由生物有机体产生的乙醇被称为生物乙醇，因此与纯化学方法产生的乙醇不同。生物乙醇是商业生产的，并且可以用作内燃机中的液体燃料(燃料乙醇)、工业产品中的成分(工业乙醇)或酒精饮料中的成分(饮用乙醇)。

2、生物有机体(如酵母)产生生物乙醇。所选择的酵母有利于乙醇生产，因此可以优化生产工艺和盈利能力。用于商业生产乙醇的酵母需要几个特征，包括足够的乙醇代谢产量、足够的乙醇耐受性、可接受的副产物产量、足够的发酵动力学以及发酵过程中一定程度的耐热性。酵母(saccharomyces)属的酵母表现出商业生产乙醇所需的许多这些特征。包含酵母(saccharomyces)的商业酵母产品包括：ethanolangel super和fali(ab)。尽管商业酵母菌株和产品具有生产乙醇的有利特性，但越来越需要提高乙醇生产的效率以降低制造的成本。

3、因此，需要新的和改进的酵母(saccharomyces)菌株，从中生产新的和改进的酵母产品。改进的酵母菌株和产品需要能够通过提供比目前商业使用的酵母菌株和产品更高的糖向乙醇的转化率、更高的温度耐受性、更高的发酵抑制剂耐受性和更快的发酵动力学来提高商业乙醇生产的效率。

技术实现思路

1、在一方面，本公开涉及一种酵母(saccharomyces)菌株，其选自：(a)酵母(saccharomyces)菌株y1912，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68003保藏；(b)酵母(saccharomyces)菌株y1913，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68004保藏；(c)酵母(saccharomyces)菌株y1914，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68005保藏；(d)酵母(saccharomyces)菌株y1919，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68006保藏；(e)酵母(saccharomyces)菌株y1923，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68007保藏；(f)酵母(saccharomyces)菌株y1927，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68008保藏；以及(g)酵母(saccharomyces)菌株y1929，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68009保藏。

2、在另一方面，本公开涉及一种酵母(saccharomyces)菌株的衍生物，所述酵母(saccharomyces)菌株选自：(a)酵母(saccharomyces)菌株y1912，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68003保藏；(b)酵母(saccharomyces)菌株y1913，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68004保藏；(c)酵母(saccharomyces)菌株y1914，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68005保藏；(d)酵母(saccharomyces)菌株y1919，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68006保藏；(e)酵母(saccharomyces)菌株y1923，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68007保藏；(f)酵母(saccharomyces)菌株y1927，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68008保藏；以及(g)酵母(saccharomyces)菌株y1929，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68009保藏。在一个实施方案中，所述酵母菌株或所述衍生物包含一种或多种定义特征，所述定义特征选自：(a)在相同的发酵条件下，比酵母(saccharomyces)菌株y1609具有更高的乙醇产量；(b)在32℃至36℃的温度下，与酵母(saccharomyces)菌株y1609相比，具有增加的温度耐受性；(c)在相同的发酵条件下，比酵母(saccharomyces)菌株y1609具有更低的甘油产量；(d)在有机酸存在下，ph值从约4.0至约5.2时，与酵母(saccharomyces)菌株y1609相比，具有增加的有机酸耐受性；以及(e)在相同的发酵条件下，与酵母(saccharomyces)菌株y1609相比，具有增加的发酵速率。在另一个实施方案中，相对于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株y1609，所述酵母菌株或所述衍生物在发酵50小时后产生多至少约0.5％的乙醇。在另一个实施方案中，相对于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株y1609，所述酵母菌株或所述衍生物在发酵50小时后产生少至少约2％的甘油。在另一个实施方案中，所述酵母菌株或所述衍生物在发酵24小时后的发酵速率比酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株y1609高至少约2％。在另一个实施方案中，所述温度为32℃。在另一个实施方案中，相对于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌株y1609，所述酵母菌株或所述衍生物在发酵50小时后产生多至少约5％的乙醇。在另一个实施方案中，相对于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株y1609，所述酵母菌株或所述衍生物在发酵50小时后产生少至少约3％的甘油。在另一个实施方案中，所述酵母菌株或所述衍生物在发酵24小时后的发酵速率比酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌株y1609高至少约10％。在另一个实施方案中，所述温度为36℃。在另一实施方案中，所述有机酸包括乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸或其组合。

3、本公开的另一方面提供了一种生产如本文所述的酵母(saccharomyces)菌株的衍生物的方法，包括：(a)提供：(i)第一酵母菌株，其中所述第一酵母菌株选自酵母(saccharomyces)菌株y1912、y1913、y1914、y1919、y1923、y1927、y1929及其衍生物；以及(ii)第二酵母菌株，其中所述第二酵母菌株位于酵母菌狭义种(saccharomyces sensustricto)进化枝中；(b)诱导所述第一酵母菌株和所述第二酵母菌株的孢子形成；(c)筛选和选择来自所述第一酵母菌株的孢子和来自所述第二酵母菌株的孢子；(d)将所述第一酵母菌株的选定孢子与所述第二酵母菌株的选定孢子杂交；以及(e)筛选或选择衍生菌株。在一个实施方案中，步骤(c)包括筛选或选择表现出酵母(saccharomyces)菌株y1912、y1913、y1914、y1919、y1923、y1927、y1929或其衍生物的一种或多种定义特征的孢子。在另一个实施方案中，步骤(e)包括筛选或选择表现出酵母(saccharomyces)菌株y1912、y1913、y1914、y1919、y1923、y1927、y1929或其衍生物的一种或多种定义特征的杂种。

4、本公开的另一方面提供了一种生产如本文所述的酵母(saccharomyces)菌株的衍生物的方法，包括：(a)提供：(i)第一酵母菌株，其中所述第一酵母菌株选自酵母(saccharomyces)菌株y1912、y1913、y1914、y1919、y1923、y1927、y1929及其衍生物；以及(ii)在酵母菌狭义种(saccharomyces sensu stricto)进化枝中的一种或多种另外的酵母菌株；(b)诱导所述第一酵母菌株和所述一种或多种另外的酵母菌株的孢子形成以产生孢子；(c)混合步骤(b)的所有孢子以允许孢子杂交；以及(d)筛选或选择衍生菌株。在一个实施方案中，步骤(d)包括筛选或选择表现出酵母(saccharomyces)菌株y1912、y1913、y1914、y1919、y1923、y1927或y1929的一种或多种定义特征的杂种。

5、本公开的另一方面提供了如本文所述的酵母菌株或如本文所述的衍生物的突变酵母。

6、本公开的另一方面提供了生产如本文所述的突变酵母的方法，其中所述突变酵母通过将所述酵母菌株与诱变剂接触而突变。在一个实施方案中，所述诱变剂是甲磺酸乙酯(ems)、紫外线(uv)、x射线、甲磺酸甲酯(mms)、亚硝酸、亚硝基胍(nng)、吖啶芥、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨丙基氨基]吖啶·2(icr-170)或氮芥。

7、本公开的另一方面提供了生产如本文所述的突变酵母的方法，其中所述突变酵母通过将所述衍生物与诱变剂接触而突变。在一个实施方案中，所述诱变剂是甲磺酸乙酯(ems)、紫外线(uv)、x射线、甲磺酸甲酯(mms)、亚硝酸、亚硝基胍(nng)、吖啶芥、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨丙基氨基]吖啶·2(icr-170)或氮芥。

8、本公开的另一方面提供了如本文所述的酵母菌株或如本文所述的衍生物的进化酵母。

9、本公开的另一方面提供了一种生产如本文所述的进化酵母的方法，其中通过对所述酵母菌株施加选择压力来诱导进化。

10、本公开的另一方面提供了一种生产如本文所述的进化酵母的方法，其中通过对所述衍生物施加选择压力来诱导进化。

11、本公开的另一方面提供了一种如本文所述的酵母菌株或如本文所述的衍生物的基因修饰酵母。在一个实施方案中，使用基因编辑改变所述基因修饰酵母的核酸序列。

12、本公开的另一方面提供了一种如本文所述的酵母菌株或如本文所述的衍生物的重组酵母。在一个实施方案中，所述重组酵母包含修饰以抑制基因表达、增强基因表达、引入基因或删除基因。

13、本公开的另一个方面提供了一种通过将底物与发酵生物体接触从所述底物生产乙醇的方法，其中所述发酵生物体选自：(a)酵母(saccharomyces)菌株y1912，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68003保藏，或其衍生物；(b)酵母(saccharomyces)菌株y1913，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68004保藏，或其衍生物；(c)酵母(saccharomyces)菌株y1914，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68005保藏，或其衍生物；(d)酵母(saccharomyces)菌株y1919，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68006保藏，或其衍生物；(e)酵母(saccharomyces)菌株y1923，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68007保藏，或其衍生物；(f)酵母(saccharomyces)菌株y1927，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68008保藏，或其衍生物；以及(g)酵母(saccharomyces)菌株y1929，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68009保藏，或其衍生物。在一个实施方案中，所述底物包含或来源于甘蔗、甜菜、甜高粱、龙舌兰、玉米、小麦、水稻、大麦、黑麦、高粱、小黑麦、马铃薯、甘薯、木薯或其组合。在另一个实施方案中，所述酵母菌株包含一种或多种定义特征，所述定义特征选自：(a)在相同的发酵条件下，比酵母(saccharomyces)菌株y1609具有更高的乙醇产量；(b)在32℃至36℃的温度下，与酵母(saccharomyces)菌株y1609相比，具有增加的温度耐受性；(c)在相同的发酵条件下，比酵母(saccharomyces)菌株y1609具有更低的甘油产量；(d)在有机酸存在下，ph值从约4.0至约5.2时，与酵母(saccharomyces)菌株y1609相比，具有增加的有机酸耐受性；以及(e)在相同的发酵条件下，与酵母(saccharomyces)菌株y1609相比，具有增加的发酵速率。在另一个实施方案中，所述乙醇用于燃料乙醇、工业乙醇、饮用乙醇或其组合。在另一个实施方案中，使用淀粉生产所述乙醇。在另一个实施方案中，同步糖化发酵(ssf)或连续发酵以生产所述乙醇。在另一个实施方案中，使用糖生产所述乙醇。在另一个实施方案中，使用分批发酵或连续发酵以生产所述乙醇。在另一个实施方案中，使用木质纤维素糖生产所述乙醇。在另一个实施方案中，使用同步糖化发酵(ssf)或分步水解发酵(shf)以生产所述乙醇。

14、本公开的另一方面提供了一种组合物，其包含如本文所述的酵母菌株或如本文所述的衍生物以及选自表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、保护剂和抗氧化剂的一种或多种组分。在一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种定义特征，所述定义特征选自：(a)在相同的发酵条件下，比fali更高的乙醇产量；(b)在32℃至36℃的温度下，与fali相比，具有增加的温度耐受性；(c)在相同的发酵条件下，比fali具有更低的甘油产量；(d)在有机酸存在下，ph值从约4.0至约5.2时，与fali相比，具有增加的有机酸耐受性；以及(e)在相同的发酵条件下，与fali相比，具有增加的发酵速率。

15、本公开的另一方面提供了一种通过将生物质与如本文所述的组合物接触从所述生物质生产乙醇的方法。在一个实施方案中，所述乙醇用于燃料乙醇、工业乙醇、饮用乙醇或其组合。在另一个实施方案中，使用淀粉生产所述乙醇。在另一个实施方案中，同步糖化发酵(ssf)或连续发酵以生产所述乙醇。在另一个实施方案中，使用糖生产所述乙醇。在另一个实施方案中，使用分批发酵或连续发酵以生产所述乙醇。在另一个实施方案中，使用木质纤维素糖生产所述乙醇。在另一个实施方案中，使用同步糖化发酵(ssf)或分步水解发酵(shf)以生产所述乙醇。

16、本公开的另一方面提供了一种通过将底物与发酵生物体接触从所述底物生产发酵产物的方法，其中所述发酵生物体选自：(a)酵母(saccharomyces)菌株y1912，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68003保藏，或其衍生物；(b)酵母(saccharomyces)菌株y1913，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68004保藏，或其衍生物；(c)酵母(saccharomyces)菌株y1914，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68005保藏，或其衍生物；(d)酵母(saccharomyces)菌株y1919，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68006保藏，或其衍生物；(e)酵母(saccharomyces)菌株y1923，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68007保藏，或其衍生物；(f)酵母(saccharomyces)菌株y1927，该菌株的代表性样品已以nrrl专利保藏编号y-68008保藏，或其衍生物；以及(g)酵母(saccharomyces)菌株y1929，该菌株的代表性样品已经以nrrl专利保藏编号y-68009保藏，或其衍生物。在一个实施方案中，所述底物包含或来源于甘蔗、甜菜、甜高粱、龙舌兰、玉米、小麦、水稻、大麦、黑麦、高粱、小黑麦、马铃薯、甘薯、木薯或其组合。在另一个实施方案中，所述发酵产物是乙醇。在另一个实施方案中，所述乙醇用于燃料乙醇、工业乙醇、饮用乙醇或其组合。在另一个实施方案中，使用分批发酵、连续发酵、同步糖化发酵(ssf)或分步水解发酵(shf)来生产所述发酵产物。

17、本公开提供了根据以下详细描述和附图将显而易见的其他方面和实施方案。