体外或离体组织切片的维持和/或培养

本发明涉及体外或离体组织切片的维持和/或培养。特别地，本发明涉及肿瘤切片的维持和/或培养。肿瘤切片可用于研究癌症/肿瘤生物学，尤其是个性化药物测试。

背景技术：

1、对于癌症/肿瘤生物学的研究，了解肿瘤/癌症的复杂体外环境是很重要的。例如，随着肿瘤类器官技术的出现，个性化肿瘤学领域正在迅速崛起，该技术重现了患者肿瘤中的癌细胞异质性(drost和clevers,2018)。然而，这些癌症类器官模型本质上过于简单，因为与患者肿瘤中高度复杂和异质的基质和间质情形相比，它们缺乏肿瘤微环境(tme)的许多组分(tang等人,2021)。尽管已经努力将肿瘤间质掺入基于类器官的培养物中(cattaneo等人,2020)，但这些模型并未考虑间质异质性以及细胞外基质、癌症和间质细胞的独特空间分布；所有这些都是影响肿瘤进展和tme靶向药物、特别是免疫检查点抑制剂(ici)的功效的重要参数(bruni等人,2020)。

2、在肿瘤建模谱的另一端，已经开发了人源化(患者源性异种移植)pdx小鼠用于评估免疫疗法，但它们建立起来通常成本高、通量低且耗时。离体患者源性肿瘤外植体培养物(包括肿瘤切片)涉及切除的人类肿瘤片段的培养，所述切除的人类肿瘤片段可能保留原始肿瘤的整个tme。尽管有强有力的证据表明这些平台能够预测患者对化疗的反应，但这些平台尚未在转化研究中广泛采用，这可能是因为在过去几十年中，癌症细胞系、类器官和pdx模型系统(所有这些都可以维持更长的时间)得到了指数式使用(rowley等人,2020)。然而，随着人们日益认识到患者特异性tme在介导患者肿瘤中药物(尤其是ici)反应的重要性，迫切需要恢复患者源性肿瘤切片模型，以评价tme靶向策略并描述抗性机制。

3、虽然在许多方面是有利的，但受试者源性外植体培养物受到离体组织活力较差的限制；通常所述组织在约3至6天的短时间范围内分解(gerlach等人,2014)。这使得进行需要更长培养时间的药物测试和机制研究变得极具挑战性。通常认为，随着时间的推移培养物活力降低的关键促成因素是从血液供应中去除肿瘤组织后的缺氧(davies等人,2015)。延长这种受试者源性外植体培养物的维持和培养仍然极具挑战性。

4、目前培养受试者源性外植体培养物或肿瘤切片的方法通常依赖于使用人工基质，如在培养皿中的漂浮切片培养物，或使用ptfe细胞培养插入物(使用最广泛)进行机械支持。虽然这些培养条件能够使肿瘤切片的培养持续几天，但培养基质并未针对组织维持/培养外植体或肿瘤切片的具体要求进行优化。

5、专利cn 107217039b描述了一种方法，所述方法能够使用水凝胶对肿瘤组织进行3d培养，并将水凝胶与基质胶和vitro-gel 3d rgd作为培养基质进行比较。根据该专利，与基质胶相比，水凝胶的使用能够更好地将肿瘤组织固定到塑料培养皿上，成本更低并且操作更简单。该专利还描述了一种用于培养来自几种癌症类型的组织的经优化的培养基。然而，该专利没有提及在该专利中使用的水凝胶的组成，除了提及它是合成肽生物纳米材料之外。更重要的是，在该描述的方法中，肿瘤块似乎完全包埋在培养基质的三维(3d)中。

6、此外，该专利描述了一种使用眼科仪器切割的肿瘤块的方法，所述方法产生具有不均匀表面积和大小的肿瘤块，所述肿瘤块可能不适用于下游分析，如培养中的组织的实时成像和其他实时研究。此外，该专利描述了一种非常受限的下游分析方法，所述方法涉及将组织固定在水凝胶中进行免疫组织化学或免疫荧光。

7、bailey等人(2020)报道了包埋在水凝胶中的正常肺组织切片的培养。然而，在本文中，组织切片完全夹在两层水凝胶之间。

8、此外，salas等人(2020)报道了使用未改性的藻酸盐支架来培养子宫平滑肌瘤的肿瘤切片。

9、总之，解决适用于下游分析的离体或体外培养肿瘤组织的现有方法的局限性是非常可取的。

技术实现思路

1、根据第一方面，本发明提供了一种用于维持和/或培养组织切片的方法；所述方法包括：

2、(i)提供组织切片；

3、(ii)提供包含缀合肽的水凝胶；

4、(iii)将所述组织切片置于所述包含缀合肽的水凝胶上；以及

5、(iv)使用培养基在所述水凝胶上维持和/或培养所述组织切片。

6、重要的是，应当理解所述水凝胶的生物化学和生物物理特性可以被调节(可调的或适合的)以用于不同类型的组织切片的最佳维持和/或培养。本发明的方法可用于维持和/或培养任何组织切片。例如，所述组织切片可以来自肿瘤。因此，本发明可以用于维持和/或培养肿瘤切片。还应当理解，所述方法保持了组织切片或肿瘤切片的组成，特别是保持了组织切片或肿瘤切片的细胞组成。

7、任何合适的水凝胶可用于本发明。合适的水凝胶包括但不限于聚合物、合成水凝胶、半合成水凝胶。

8、还应当理解，所述水凝胶的缀合肽可以用于交联所述水凝胶和/或呈现生化线索。

技术特征：

1.一种用于维持和/或培养组织切片的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶包含聚合物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述水凝胶包括合成水凝胶或半合成水凝胶。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述合成水凝胶包含合成聚合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述合成聚合物包括聚(乙二醇)。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述半合成水凝胶包含用至少一个化学基团改性的天然聚合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述半合成水凝胶包含用至少一个化学基团改性的透明质酸、胶原蛋白或明胶。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述化学基团用于交联所述水凝胶。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述水凝胶包含用于交联所述水凝胶的聚合物交联剂。

10.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述化学基团包括硫醇和/或丙烯酸根基团。

11.根据权利要求3或6至10中任一项所述的方法，其中所述半合成水凝胶包含具有缀合肽的硫醇化透明质酸。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述肽用于交联所述水凝胶和/或呈现/提供生化线索。

13.根据权利要求12所述的方法，其中用于交联所述水凝胶的肽包含可降解或不可降解的肽序列。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肽包括可被基质金属蛋白酶或其他蛋白酶降解的肽。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述肽包含序列pq。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述肽包含序列kgggpqgiwgqgk(seq idno:1)或乱序衍生物。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述水凝胶还包含至少一组另外的肽。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一组另外的肽呈现/提供生化线索。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一组另外的肽包含一种或多种类型的细胞外基质蛋白或含有源自细胞外基质蛋白的肽序列的肽。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白包括纤连蛋白、胶原蛋白和/或层粘连蛋白。

21.根据权利要求17至19所述的方法，其中所述至少一组另外的肽包含序列rgd或乱序衍生物。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述至少一组另外的肽包含序列grgds(seq id no:2)或乱序衍生物。

23.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述肽包含一种或多种类型的细胞外基质蛋白，或含有源自细胞外基质蛋白的肽序列的肽。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白包括纤连蛋白、胶原蛋白和/或层粘连蛋白。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述肽包含序列rgd或乱序衍生物。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述肽包含序列grgds(seq idno:2)或乱序衍生物。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肽包括丙烯酸酯化的肽。

28.根据权利要求2至27中任一项所述的方法，其中获得所述包含缀合肽的水凝胶的所需刚度取决于所述水凝胶中聚合物的浓度。

29.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中获得所述水凝胶的所需刚度包括或进一步包括增加或降低所述水凝胶中交联剂的浓度。

30.根据权利要求4至29中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括在所述水凝胶发生交联时将所述组织切片置于所述水凝胶上，以实现所述组织切片在所述水凝胶中的机械固定。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iv)包括使所述水凝胶与所述培养基接触。

32.根据权利要求31所述的方法，其中使所述水凝胶与所述培养基接触包括用所述培养基基本浸没或部分浸没所述水凝胶。

33.根据权利要求31所述的方法，其中用所述培养基基本浸没所述水凝胶，并用所述培养基部分浸没所述组织切片。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含至少一种rock抑制剂。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中能够培养多个组织切片，其中每个组织切片在所述水凝胶的一部分上或每个组织切片在单独的水凝胶上。

36.根据权利要求35所述的方法，其中每个组织切片具有基本均匀的厚度。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括所述组织切片的直接实时成像。

38.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，所述方法还包括测试至少一种治疗剂或潜在治疗剂对所述组织切片的作用。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法包括将在包含至少一种治疗剂或潜在治疗剂的培养基中的组织切片培养物与在不含所述至少一种治疗剂或潜在治疗剂的培养基中的组织切片培养物进行比较。

40.根据权利要求38或39所述的方法，所述方法包括测试至少一种治疗剂或潜在治疗剂与一种或多种其他治疗剂或潜在治疗剂的组合的作用。

41.根据权利要求38或39所述的方法，其中能够测试并比较两种或更多种治疗剂或潜在治疗剂。

42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂或一种或多种潜在治疗剂包括至少一种免疫检查点抑制剂。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个组织切片包含来自肿瘤的组织切片。

技术总结
本发明涉及体外或离体组织切片的维持和/或培养。特别地，本发明涉及使用水凝胶维持和/或培养组织切片的方法。在一个实施方案中，所述水凝胶是半合成水凝胶，其包含具有丙烯酸酯化肽的硫醇化透明质酸，所述丙烯酸酯化肽包含可被基质金属蛋白酶降解的KGGGPQGIWGQGK(SEQ ID NO:1)。特别地，本发明提供了一种适合于下游分析的平台，所述下游分析例如实时成像、培养中的组织的其他实时研究以及治疗剂或潜在治疗剂的测试。

技术研发人员：冯丽珊,许玉花,N·G·耶尔
受保护的技术使用者：新加坡国立大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17