核酸的富集和检测的制作方法

野生型分子库中低频变体的靶向检测对于癌症的早期检测、癌症进展的监测、癌症疗法的靶向、非侵入性产前检查、靶向特定(新)抗原的t细胞群的监测，以及对于器官移植排斥的早期预警在临床上很重要。杂交捕获和下一代测序(ngs)的组合是低频变体靶向多重检测最常应用的方法，但具有几个次优特征。一般来说，杂交捕获使感兴趣的靶区富集，但不富集变体分子。这导致绝大多数测序读段来源于野生型而不是变体分子。这是浪费，增加了成本，并且使得在储存、文库制备和测序错误的背景下难以检测罕见变体。这导致ngs对于变体的常规检测特异性不足，低于～0.1％。改良文库制备方法(诸如双链体测序)可以提高特异性，从单分子中得到准确的测序数据。不幸的是，双链测序等方法也会降低灵敏度(例如，通过修改文库制备方法以避免末端修复以及通过故意施加分子瓶颈)。这里描述的方法允许使用例如基于焦磷酸解(ppl)的改良杂交捕获方法富集位于感兴趣的靶区内的变体分子。这既减少所需测序读段的数目，又为低于当前ngs检测极限的低频变体分子的多重检测打开了大门。

背景技术：

技术实现思路

1、在一些实施方案中，本文提供了基于焦磷酸解反应的杂交方法。这些方法利用焦磷酸解的双链特异性；焦磷酸解是用包含核苷酸错配的阻断基团的单链寡核苷酸底物或双链底物不能有效进行的反应。

2、例如，在一些实施方案中，本文提供的方法包括使样品(例如，含有两种或更多种不同的核酸分子)与探针和焦磷酸解反应试剂接触，以及基于探针与第一和第二核酸分子的不同互补性，使第一核酸分子相对于第二核酸分子富集或消耗，导致探针在与第一和第二核酸分子杂交时不同水平的焦磷酸解。

3、例如，在一些实施方案中，方法包括通过使第一核酸分子与探针接触而使包含核酸分子混合物的样品中的第一核酸分子富集或消耗，所述探针与所述样品中第一核酸分子上的靶区的互补性相对于的其它核酸分子不同；进行焦磷酸解反应；以及使第一核酸分子富集或消耗。在一些实施方案中，探针与样品中第一核酸分子的靶区的互补性大于所述探针与第二核酸的相应靶区的互补性。在一些实施方案中，探针与样品中第一核酸分子的靶区的互补性小于所述探针与第二核酸的相应靶区的互补性。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸因序列变异(例如，点突变、缺失、插入、多核苷酸变化、融合等)而不同。在一些实施方案中，探针包括与具有较大互补性的序列的靶区完美互补并且与在具有较小互补性的序列的相应靶区中发现的序列变异具有一个或多个错配的序列。在一些实施方案中，探针含有与第一和第二核酸分子的靶区的一个或多个错配，但含有与具有较小互补性的核酸的靶区的更多错配。具体而言，探针设计成使得当探针与第一核酸杂交时相对于与第二核酸杂交时焦磷酸解的程度不同，从而容许基于通过焦磷酸解产生的不同反应产物相对于第二核酸选择性富集或消耗第一核酸。

4、例如，在一些实施方案中，本文提供了用于增加或降低样品中第一核酸序列与第二核酸序列的比率的方法，其包括：a)将包含第一核酸序列和第二核酸序列的样品暴露于探针，所述探针与所述第一核酸序列和第二核酸序列的互补性不同；b)进行焦磷酸解反应；以及c)使所述第一核酸序列相对于所述第二核酸序列富集或消耗。

5、在本发明的一些实施方案中，提供了一种用于增加样品中第一核酸序列与第二核酸序列的比率的方法，其中所述样品至少包含第一序列和第二序列，所述方法包括以下步骤：

6、a.将包含一种或多种核酸分析物的所述样品引入到第一反应混合物中，所述第一反应混合物包含：

7、i.与第一和第二核酸序列具有差异互补性的单链探针寡核苷酸a0(例如，其中所述探针的3'末端与第一或第二序列中的一个序列完美互补，但与另一个序列不完美互补)；

8、b.将步骤(a)产生的反应混合物引入到第二反应混合物中，所述第二反应混合物包含：

9、ii.焦磷酸解酶；和

10、iii.焦磷酸根离子源

11、其中a0(例如，完美地)与所述核酸序列中的一个序列退火以产生至少部分双链的中间产物，其中a0(例如，a0的3’-末端)与所述序列形成双链复合物并且a0在3’-5’方向上从其3’-末端焦磷酸解，而与另一个序列不太完美地(例如，不完美地)退火的任何a0由于所述不太完美的(例如，不完美的)退火而在3’-5’方向上在较小程度上焦磷酸解；

12、c.通过以下方式分离更完美地(例如，完美地)退火的任何a0序列复合物：

13、iv.使所述复合物的链由于所述焦磷酸解反应而分离(例如，解链分开)；或者

14、v.将所述反应混合物加热至足以所述复合物的链分离(例如，解链分开)的温度，但所述温度低于不太完美地(例如，不完美地)退火的任何a0链分离(例如，解链分开)所需的温度；并且

15、d.将a0及由此保持与之退火的任何核酸序列与不与a0退火的任何核酸序列分离。

16、探针可具有一种或多种组分，这些组分在焦磷酸解反应之前或期间去除。例如，探针可在其3'末端具有非互补瓣或其它阻断基团，其防止焦磷酸解或聚合酶反应的引发，直至阻断基团被去除。阻断基团可以通过任何合适的机制(例如，酶促裂解、化学反应、温度变化等)去除。当与不同的核酸分子杂交时提供差异性焦磷酸解产物的探针的序列可以位于初始探针中任何合适的位置。例如，错配序列可以位于探针3'末端的3'端碱基处。错配序列可以位于3'末端探针内部。错配序列可以位于探针中心。错配序列可以位于探针的5'半以内。

17、探针的5'末端可以包含充当标识符(例如，样品标识符)的区域(例如，5'尾)。此类序列例如可用于选择性地从特定样品或混合样品中的特定区域中逐个拉下捕获的分子。此类标识符可以在多重区域中特别有用，其中多个不同的靶标在相同的样品或相同的反应容器中进行反应。

18、可应用本发明的方法的分析物/序列是包括所寻找的靶多核苷酸序列的那些核酸，诸如天然存在的或合成的dna或rna分子。在一些实施方案中，分析物/序列通常将存在于含有它和其它生物材料的水溶液中，并且在一些实施方案中，分析物/序列将与并非出于检查目的而感兴趣的其它背景核酸分子一起存在。在一些实施方案中，分析物/序列将以相对于这些其它核酸组分低的量存在。优选地，例如在分析物源自含有细胞材料的生物样本的情况下，在进行所述方法的步骤(i)之前，这些其它核酸和外来生物材料中的一些或全部已经使用样品制备技术诸如过滤、离心、色谱法或电泳去除。

19、本发明的组合物和方法可用于任何类型的样品，包括但不限于环境(例如水、土壤、空气等)样品和生物样品。生物样品可以来自任何来源，包括植物、动物、传染病病原体等。合适地，在一些实施方案中，分析物/序列源自取自哺乳动物受试者(尤其是人类患者)的生物样品，诸如血液、血浆、痰、尿液、皮肤、活检或手术切除物。在一些实施方案中，生物样品将经受裂解，以便通过破坏存在的任何细胞来释放分析物/序列。在其它实施方案中，分析物/序列可能已经以游离形式存在于样品本身内；例如，在血液或血浆中循环的无细胞dna。本发明的组合物和方法特别适用于可能具有低等位基因分数的感兴趣分析物的历史上具有挑战性的样品类型。此类样品包括血液、尿液、细胞海绵收集的样品(例如，食道样品)、支气管肺泡灌洗(bal)来源的样品、胸膜液和脑脊液(csf)。

20、在一些实施方案中，样品是合并样品。合并样品牵涉成批地将多个样品混合在一起，其中对合并的集合进行测试。这种方法增加使用更有限量的资源可以测试的单个样品的数目。感兴趣的合并样品包括但不限于捐献的血液样品、农业样品、食品样品、精子样品和检查是否存在传染病病原体(例如，sars-cov-2、hiv、hcv等)的生物样品。在一些实施方案中，合并样品是环境收集的样品(例如，废水样品)，根据其产生的性质具有来自多个不同来源的合并样品。虽然由于样品相互稀释，样品的合并可能减少变体的等位基因分数，但它可以显著提高筛选效率。由于本文提供的技术能够以非常低的等位基因分数进行检测，因此它特别适合于合并样品的分析。在一些实施方案中，在不使用条形码或其它复杂的制备步骤的情况下合并每个初始样品的一部分并且检查合并样品。如果获得阳性结果，则可以单独检查未合并样品的剩余部分。

21、本文还提供了可与本文描述的方法一起使用的组合物(例如，试剂、试剂盒、反应混合物、仪器、软件)。例如，在一些实施方案中，这里提供了包含一种或多种对于进行本文所述的方法所必需的、足够的或有用的试剂的组合物。例如，在一些实施方案中，组合物包含：一个或多个寡核苷酸a0，其中a0包含：与已知第一序列和已知第二序列差异性互补(例如，与已知第一序列完美互补，但与已知第二序列不完美互补)的序列(例如，3’末端)；一种或多种焦磷酸解酶；和一种或多种焦磷酸根离子源。在一些实施方案中，组合物还包含靶核酸分离组分，所述靶核酸分离组分在焦磷酸解反应后将与所述探针(例如，所述探针的3’末端)更完美地(例如，完美地)互补的靶核酸分子和与所述探针(例如，所述探针的3’末端)不太完美地(例如，不完美地)互补的核酸分子分开。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种固体支持物。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，a0包含与已知第一序列或已知第二序列不互补的5'尾区。在一些实施方案中，a0还包含捕获部分。在一些实施方案中，组合物还包含一个或多个包含捕获部分的捕获寡核苷酸c0，并且其中a0的5'尾区与c0的区域互补。在一些实施方案中，捕获部分是生物素并且所述固体支持物包含链霉亲和素。在一些实施方案中，固体支持物包含捕获寡核苷酸c0并且其中a0的5'尾区与c0的区域互补。在一些实施方案中，固体支持物是珠粒(例如，磁珠或顺磁珠)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种表观遗传修饰敏感性或依赖性限制酶。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种限制性核酸内切酶。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种转座体。在一些实施方案中，组合物包含cas蛋白(例如，cas9)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种转座酶。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种连接酶。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种阻断寡核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种阻断寡核苷酸对焦磷酸解有抗性。在一些实施方案中，组合物还包含用于进行扩增(例如，pcr)、测序(例如，下一代测序)或检测反应的试剂。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种分子探针。在一些实施方案中，一种或多种分子探针是荧光标记的。在一些实施方案中，a0(例如，a0的3'末端)与人类基因组的野生型序列更多互补(例如，完美互补)，而与所述野生型序列的突变等位基因更少互补(例如，不完美互补)。在一些实施方案中，a0(例如，a0的3’末端)与人类基因组的野生型序列更少互补(例如，不完美互补)，而与所述野生型序列的突变等位基因更多互补(例如，完美互补)。在一些实施方案中，组合物还包含用于将rna转录成cdna的组分。

22、在一些实施方案中，组合物是包含本文所述的任何方法在特定时间点的反应的反应混合物。在一些实施方案中，反应混合物在焦磷酸解之前存在。在一些实施方案中，反应混合物在焦磷酸解期间存在。在一些实施方案中，反应混合物在焦磷酸解之后存在。在一些实施方案中，反应混合物包含本文所述的方法的探针/核酸杂交复合物。在一些实施方案中，反应混合物包含本文所述的方法的捕获的核酸分子。在一些实施方案中，反应混合物包含期望靶核酸的浓度高于或低于经历焦磷酸解反应的样品中存在的期望靶核酸的浓度的区域。例如，在一些实施方案中，本文提供了反应混合物，其包含：样品；处于焦磷酸解浓度(即，有利于焦磷酸解的试剂浓度)的焦磷酸解试剂；来自样品的与具有一个序列的探针杂交的第一核酸分子，其中探针的辨别区域与第一核酸分子互补；来自样品的与具有所述序列的探针杂交的第二核酸分子，其中探针的辨别区域不与第二核酸分子完美互补。在一些实施方案中，本文提供了一种反应混合物，其包含：样品；处于焦磷酸解浓度的焦磷酸解试剂；以及反应混合物的第一区域中的第一核酸分子，其中第一核酸在第一区域中的浓度高于或低于样品中第一核酸的浓度。

23、本文还提供了组合物的用途(例如，试剂盒的用途、反应混合物的用途、试剂的用途、仪器的用途、软件的用途)。例如，本文提供了组合物用于富集或消耗样品中的靶核酸的用途。

24、在一些实施方案中，本文提供了可用于本文所述的方法中的设备和仪器。在一些实施方案中，设备和仪器可用于收集样品并将样品分配到反应容器中。在一些实施方案中，设备和仪器提供用于进行所述方法的反应腔室。在一些实施方案中，设备和仪器提供多个区带或区域(例如，孔、通道等)，用于容纳反应和/或用于分离富集的期望靶核酸或消耗期望靶核酸。在一些实施方案中，设备和仪器可用于核酸分子的扩增或测序。在一些实施方案中，设备和仪器可用于检测核酸分子。在一些实施方案中，设备和仪器可用于接收或传输来自用户的信息。例如，设备和仪器可以包括用于接收用户指令的用户界面和用于向用户视觉呈现结果的显示器。

25、在一些实施方案中，本文提供了计算设备。计算设备可用于控制仪器或设备以促进本文所述的方法。在一些实施方案中，计算设备收集、分析和报告数据。在一些实施方案中，计算设备包括运行计算机程序的一个或多个处理器。在一些实施方案中，计算设备包括非暂时性计算机可读介质(例如，软件)，其包括指导处理器执行一个或多个计算步骤的指令。