用于治疗遗传性疾患的体内核酸酶介导的基因靶向的组合物和方法

背景技术：

1、位点特异性核酸酶(例如crispr-cas9或大范围核酸酶)在染色体中产生双链断裂(dsb)，导致了dna修复。在供体dna存在的情况下，发生同源性定向修复(hdr)，并用来自供体基因的新信息替换染色体中的遗传信息。

2、同源定向修复(hdr)是使用dna模板通过同源重组修复dna双链断裂(dsb)的过程。该模板可以来自细胞周期后期s期或g2期的细胞内，此时姐妹染色单体在有丝分裂完成之前可用。此外，可将外源修复模板递送到细胞中，最常见的是以合成的单链dna供体寡核苷酸或供体质粒的形式，以在基因组中产生精确的变化。

3、安全港位点(shs)是可以安全插入和表达基因或其他遗传元件的基因组基因座。这些shs对于有效的人类疾病基因治疗；对于研究基因结构、功能和调控；以及对于细胞标记和示踪至关重要。

4、所需要的是用于基因编辑的改进的组合物和方法。

技术实现思路

1、本文提供了用于基因编辑的组合物、方法、系统和试剂盒，其允许天然pcsk9基因的敲低或消融以及外源转基因在pcsk9基因座中的插入和/或表达。

2、在第一方面，本文提供了用于治疗遗传性疾患的系统。该系统包括基因编辑组件，该组件包含表达盒，该表达盒包含编码靶向pcsk9基因的核酸酶的核酸序列和指导核酸酶在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列。该系统还包括供体载体，该供体载体包含转基因盒，该转基因盒包含编码转基因的核酸序列和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，该供体载体进一步包含该转基因盒5′和3′的同源定向重组(hdr)臂，其中该转基因不是pcsk9。核酸酶靶向pcsk9基因。在一些实施例中，核酸酶靶向pcsk9外显子7。在一些实施例中，大范围核酸酶是arcus大范围核酸酶。

3、在一些实施例中，基因编辑组件包含编码cas9的序列。在某些实施例中，基因编辑载体进一步包含编码包含至少20个核苷酸的种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。

4、在其它实施例中，供体载体进一步包含编码包含至少20个核苷酸的种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。

5、在另一方面，本文提供了用于治疗遗传性疾患的系统。该系统包括基因编辑组件，其包含编码靶向pcsk9基因的核酸酶的核酸序列。该系统还包括供体载体，该供体载体包含转基因盒，该转基因盒包含编码转基因的核酸序列和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，该供体载体进一步包含该转基因盒5′和3′的同源定向重组(hdr)臂，其中该转基因不是pcsk9。核酸酶靶向pcsk9基因。在某些实施例中，基因编辑组件以脂质纳米颗粒的形式提供。

6、在一些实施例中，基因编辑组件包含编码cas9的序列。在某些实施例中，基因编辑载体进一步包含编码包含至少20个核苷酸的种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。

7、在其它实施例中，供体载体的另外的组分包含编码包含至少20个核苷酸种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。

8、在某些实施例中，转基因涉及肝代谢疾患。在某些实施例中，转基因是otc、pku、ctln1或ldlr。

9、在某些实施例中，载体是腺相关病毒(aav)载体，并且载体包含aav 5′itr和aav3′itr。

10、在另一个实施例中，用于治疗遗传性疾患的双载体系统包括基因编辑aav，其包含aav衣壳和第一载体基因组，该第一载体基因组包含：5′itr，编码大范围核酸酶的序列，所述大范围核酸酶在指导所述大范围核酸酶在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列控制下靶向pcsk9，和3′itr；以及供体aav载体，其包含aav衣壳和第二载体基因组，该第二载体基因组包含：5′itr、5′同源定向重组(hdr)臂、转基因和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，3′hdr臂和3′itr，其中该转基因不编码pcsk9。

11、在另一个实施例中，用于治疗遗传性疾患的双载体系统包括基因编辑aav，其包含aav衣壳和第一载体基因组，该第一载体基因组包含5′itr、5′核定位信号(nls)、编码cas9的序列和指导sacas9在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列、3′nls和3′itr；和供体aav载体，其包含aav衣壳和第二载体基因组，该第二载体基因组包含：5′itr、5′同源定向重组(hdr)臂、转基因和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，3′hdr臂、u6启动子、包含特异性结合pcsk9基因中的靶位点的至少20个核苷酸的sgrna，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′，和3′itr，其中该转基因不编码pcsk9。

12、在另一个实施例中，用于治疗遗传性疾患的双载体系统包括基因编辑aav载体，其包含aav衣壳和第一载体基因组，该第一载体基因组包含5′itr、u6启动子、包含特异性结合该pcsk9基因中的靶位点的至少20个核苷酸的sgrna，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′，5′核定位信号(nls)、编码cas9的序列和指导cas9在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列、3′nls和3′itr；和供体aav载体，其包含aav衣壳和第二载体基因组，该第二载体基因组包含：5′itr、5′同源定向重组(hdr)臂、转基因和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，3′hdr臂和3′itr。

13、在一些实施例中，基因编辑aav载体和供体aav载体具有相同的aav衣壳。在其它实施例中，基因编辑aav载体和供体aav载体具有不同的aav衣壳。在一些实施例中，aav衣壳选自aav8、aav9、rh10、aav6.2、aav3b、hu37、rh79和rh64。

14、在另一方面，提供了通过共同施用本文所述的双载体系统来治疗人类疾患的方法。

15、在另一方面，提供了在受试者中治疗肝代谢疾患的方法，该方法包括向患有肝代谢疾患的受试者共同施用基因编辑aav载体，该载体包含编码核酸酶的序列和指导核酸酶在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列，以及供体aav载体，其包含转基因和指导转基因在靶细胞中的表达的调控序列，该供体载体进一步包含转基因盒5′和3′的同源定向重组(hdr)臂，其中该转基因不是pcsk9。在某些实施例中，肝脏代谢疾患是鸟氨酸氨甲酰基转移酶。在其它实施例中，家族性高胆固醇血症或苯丙酮尿症。在一个实施例中，受试者是新生儿。

16、在另一方面，提供了用于治疗遗传性疾患的系统。该系统包括脂质纳米颗粒(lnp)，其包含编码靶向pcsk9基因的核酸酶的mrna序列；和供体aav载体，其包含转基因和指导其在靶细胞中的表达的调控序列，该供体载体进一步包含转基因5′和3′的同源定向重组(hdr)臂，其中该转基因不是pcsk9。在一些实施例中，核酸酶靶向pcsk9外显子7。在一些实施例中，大范围核酸酶是arcus大范围核酸酶。

17、在其它实施例中，基因编辑载体编码cas9。在某些实施例中，基因编辑载体还编码包含特异性结合pcsk9基因中的靶位点的至少20个核苷酸的sgrna，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。在一些实施例中，其中该系统包括lnp，该lnp包含cas9编码序列和grna两者。

18、在其它实施例中，供体载体还编码包含至少20个核苷酸的种子区的sgrna的序列，其中sgrna特异性结合pcsk9基因中的靶位点，所述靶位点位于被cas9特异性识别的原型间隔子相邻基序(pam)的5′。

19、在又一方面，提供了用于治疗遗传性疾患的双载体系统。该系统包括基因编辑载体，其包含表达盒，该表达盒包含编码核酸酶的核酸序列和指导核酸酶在包含pcsk9基因的靶细胞中的表达的调控序列；以及供体载体，其包含编码用于从pcsk9基因座表达的外源产物的核酸序列，其中插入的核酸序列不编码pcsk9，其中该系统进一步包含指导核酸酶特异性靶向天然pcsk9基因座的序列；并且其中靶细胞中的天然pcsk9任选地在用双载体系统给药后被消除或减少。

20、在又一方面，提供了使用本文所述的系统治疗患者的方法，其中患者的天然pcsk9表达水平降低并且其中患者表达外源产物。

21、在又一方面，提供了工程化的编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的序列。还包括载体、表达盒和包含其的重组病毒。

22、本发明的其它方面和优点将从本发明的以下详细描述中变得明显。