产生用于治疗肌营养不良的重组AAV载体的制作方法

本公开内容属于基因治疗领域。更具体地，本公开内容提供了用于表达小型化的人微小抗肌营养不良蛋白(微小抗肌营养不良蛋白)基因的基因治疗载体，例如腺相关病毒(aav)载体，其中所述aav是从在悬浮条件下培养的贴壁细胞中产生的。本公开内容还提供了使用这些载体在骨骼肌(包括膈肌和心肌)中表达微小抗肌营养不良蛋白，以及保护肌纤维免受损伤、增加肌力、减少和/或预防患有肌营养不良的受试者中的纤维化的方法。

背景技术：

1、肌肉质量和力量对日常活动(例如运动和呼吸)以及全身新陈代谢的重要性不言而喻。肌肉功能缺陷会导致肌营养不良(md)，其表征为肌无力和肌萎缩，并严重影响生活质量。最典型的md是由编码抗肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(dapc)的成员的基因的突变所导致。这些md是由与通过dapc束缚的肌膜-细胞骨架的缺失相关的膜脆性所导致的。杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy,dmd)是最具破坏性的肌肉疾病之一，每5,000名新生男婴中就有1人患病。

2、dmd是由dmd基因突变导致mrna减少和抗肌营养不良蛋白缺乏所引起的，抗肌营养不良蛋白是一种427kd的与抗肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(dapc)相关的肌膜蛋白(hoffman等人，cell51:919-28,1987)。dapc由肌肉肌膜上的多种蛋白质组成，这些蛋白质通过抗肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和α-抗肌营养不良蛋白聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在细胞外基质(ecm)和细胞骨架之间形成结构连接。这些结构连接在收缩过程中稳定肌肉细胞膜，并防止收缩引起的损伤。缺失抗肌营养不良蛋白后，膜脆性会导致肌膜撕裂和钙的流入，触发钙激活蛋白酶和节段性纤维坏死(straub等人，curropin.neurol.10:168-75(1997))。这种肌肉变性和再生的不受控制的循环最终会耗尽肌肉干细胞群(sacco等人，cell 143:1059-1071(2010)；wallace等人,annu rev physiol 71:37-57(2009))，导致进行性肌无力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕形成。

3、如果没有抗肌营养不良蛋白或微小抗肌营养不良蛋白的膜稳定作用，dmd将表现为组织损伤和修复的不受控制的循环，最终通过结缔组织增生以纤维化瘢痕组织替换失去的肌纤维。纤维化表征为ecm基质蛋白(包括胶原蛋白和弹性蛋白)的过度沉积。ecm蛋白主要由在响应压力和炎症时被激活的成纤维细胞释放的细胞因子(例如tgfβ)产生。虽然dmd的主要病理特征是肌纤维变性和坏死，但纤维化作为一种病理结果也会产生同样的影响。在dmd患者中，纤维化组织的过度生成限制了肌肉再生，并导致进行性肌无力。在一项研究中，在最初的dmd肌肉活检中存在纤维化与10年随访的不良运动预后高度相关(desguerre等人，j neuropathol exp neurol 68:762-767(2009))。这些结果表明，纤维化是导致dmd肌肉功能障碍的主要因素，并强调了在出现明显纤维化之前进行早期干预的必要性。

4、国际公开号wo2019/245973a1(其通过引用整体并入本文)描述了用aav载体递送微小抗肌营养不良蛋白基因来治疗人类受试者的肌营养不良(例如dmd)，然而，本领域仍然需要改进产生此类aav载体的方法，特别是适合用于大规模产生此类基因治疗载体的方法。

技术实现思路

1、本公开内容涉及通过本文所述的悬浮播种工艺产生的基因治疗载体(例如aav载体)，所述载体在骨骼肌(包括膈肌和心肌)中表达人微小抗肌营养不良蛋白基因，从而保护肌纤维免受损伤、增加肌力、减少和/或预防纤维化。

2、本公开内容提供了通过悬浮播种工艺在贴壁哺乳动物细胞中产生重组腺相关病毒(raav)raavrh74.mhck7.微小抗肌营养不良蛋白的方法，包括：(a)在n-2容器中用包含血清的第一生长培养基培养细胞；(b)从第一培养基中移出细胞；(c)将来自步骤(b)的细胞接种到n-1容器中的不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；(d)在悬浮条件下培养n-1容器中的细胞；以及(e)用来自步骤(d)的细胞接种生物反应器中的第三培养基。

3、在一些方面，本文所述方法中使用的raav包含seq id no:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。在一些方面，所述raav包含seq id no:7的mhck7启动子序列。在一些方面，所述raav包含seq id no:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和seq id no:7的mhck7启动子序列。

4、在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括：(f)用包含raavrh74.mhck7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒、包含aav rep基因和aav cap基因的质粒以及腺病毒辅助质粒转染贴壁细胞。

5、在一些方面，包含raavrh74.mhck7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒包含：seq id no:9的核酸序列；seq id no:3的核苷酸55-5021；或seq id no:8的核苷酸1-4977。在一些方面，包含aav rep基因和aav cap基因的质粒包含aav2 rep基因和raavrh74cap基因。在一些方面，腺病毒辅助质粒包含腺病毒5e2a、e4orf6和va rna基因。

6、在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括：(g)裂解贴壁细胞。在一些方面，通过冻融、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、去污剂裂解或其组合来裂解贴壁细胞。

7、在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括(h)通过至少一个柱色谱步骤纯化raav。在一些方面，所述至少一个柱色谱步骤包括阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱或其组合。

8、在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括在n-3容器中用所述第一生长培养基培养细胞。在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括在n-4容器中用所述第一生长培养基培养细胞。

9、在一些方面，生物反应器是贴壁生物反应器。在一些方面，从在贴壁生物反应器中产生的培养物纯化raav。

10、在一些方面，生物反应器中的第三培养基包含至少一种促进细胞粘附的因子。在一些方面，所述至少一种促进细胞粘附的因子选自由血清、fbs、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、钙离子、细胞外基质的蛋白聚糖或非蛋白聚糖多糖及其组合组成的组。在一些方面，生物反应器中的第三培养基包含dmem和10％fbs。

11、在一些方面，贴壁细胞在悬浮条件下培养约48-72小时。

12、在一些方面，n-1容器是悬浮摇瓶。

13、在一些方面，贴壁细胞选自由hela细胞、cho细胞、hek-293细胞、vero细胞、bhk细胞、mdck细胞、mdbk细胞和cos细胞组成的组。在一些方面，贴壁细胞是hela细胞或hek-293细胞。在一些方面，贴壁细胞是hek-293细胞。在一些方面，贴壁细胞不是悬浮适应细胞。在一些方面，在悬浮条件下培养细胞不改变所述细胞的贴壁依赖性。在一些方面，所述培养不改变所述细胞以产生新的细胞系。

14、本公开内容还提供了包含重组腺相关病毒(raav)raavrh74.mhck7.微小抗肌营养不良蛋白的组合物，其中raav通过本文所述的任何方法制造。在一些方面，所述组合物包含：a)包含seq id no:9的核酸序列的raav颗粒；b)包含seq id no:3的核苷酸55-5021的raav颗粒；和/或c)包含seq id no:8的核苷酸1-4977的raav颗粒。

15、在一些方面，本公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗肌营养不良的组合物，其包含重组腺相关病毒(raav)raav.rh74mhck7.微小抗肌营养不良蛋白，其中raav在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在n-1容器中培养。在一些方面，raav包含seq id no:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。在一些方面，raav包含seq id no:7的mhck7启动子序列。在一些方面，raav包含seq id no:7的mhck7启动子序列和seq id no:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。

16、在一些方面，所述组合物包含：(a)包含seq id no:9的核酸序列的raav；(b)包含seq id no:9的核酸序列的raav颗粒；(c)包含seq id no:3的核苷酸55-5021的raav；(d)包含seq id no:3的核苷酸55-5021的raav颗粒；(e)包含seq id no:8的核苷酸1-4977的raav；和/或(f)包含seq id no:8的核苷酸1-4977的raav颗粒。

17、本公开内容还提供了在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的方法，包括向所述人类受试者施用包含本文所述的raav的组合物。在一些方面，使用全身施用途径并且以约5.0x1012vg/kg至约1.0x1015vg/kg的剂量施用raav。在一些方面，全身施用途径是静脉内途径并且施用的raav的剂量为约2x1014vg/kg。

18、在一些方面，raav的剂量以约10ml/kg的浓度施用。在一些方面，raav通过注射、灌注或植入施用。在一些方面，raav通过灌注在约一小时内施用。在一些方面，raav经由外周肢体静脉通过静脉内途径施用。

19、在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良(becker’smuscular dystrophy)。在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良。

20、在一些方面，与施用raav之前的微小抗肌营养不良蛋白基因表达水平相比，施用raav之后在受试者的细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。在一些方面，通过在施用所述raav之前和之后通过蛋白质印迹测量肌肉活检中的微小抗肌营养不良蛋白水平来检测所述细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。在一些方面，与施用之前相比，施用raav之后的表达为至少55.4％。

21、在一些方面，与施用raav之前的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量相比，施用raav之后受试者的肌肉组织中的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比增加。在一些方面，如在施用raav之前和之后的肌肉活检中通过免疫荧光(if)所检测的，微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比为至少70.5％，平均强度为至少116.9％。在一些方面，通过载体基因组计数的微小抗肌营养不良蛋白转导为每个细胞核至少3.87个平均载体基因组拷贝。

22、在一些方面，所述组合物施用于基因分型的患者。在一些方面，对患者的人抗肌营养不良蛋白(dmd)基因进行基因分型。在一些方面，对基因分型的患者针对人抗肌营养不良蛋白(dmd)基因的外显子18-79中的至少一种突变进行基因分型。

23、在一些方面，治疗肌营养不良的方法进一步包括在向所述人类受试者施用所述组合物之前对所述人类受试者的dmd基因进行基因分型。在一些方面，基因分型检测dmd基因的外显子18至79中的至少一个突变。在一些方面，所述至少一种突变是移码缺失、移码重复、过早终止或导致人抗肌营养不良蛋白的表达缺失的其他致病性变异。

24、本公开内容还提供了本文所述的组合物用于在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的用途。在一些方面，本公开内容还提供了本文所述的组合物在制备用于治疗肌营养不良的药物中的用途。

25、在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良。