本文公开了使用稳定同位素标记(sil)肽图谱确定半胱氨酸缀合的抗体药物缀合物与小分子细胞毒性有效负载例如mmaf或mmae的位点特异性缀合水平的方法。
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：：0、发明背景1、抗体药物缀合物(adc)是一类增长的生物药物，其将单克隆抗体(mab)的特异性与细胞毒性小分子药物的效力相结合，用于靶向肿瘤疗法(hafeez等人,antibody–drugconjugates for cancer therapy.molecules.2020,25,4764；和boni等人,theresurgence of antibody drug conjugates in cancer therapeutics:novel targetsand payloads.am soc clin oncol educ book.2020,40,1-17)。小分子有效负载通常通过半胱氨酸或赖氨酸蛋白残基缀合，从而产生不同载药(dl)种类的异质混合物(ponziani等人,antibody-drug conjugates:the new frontier ofchemotherapy.int.j.mol.sci.2020,21,5510)。adc的总体药物与抗体比率(dar)由于其对药物效力和功效的影响而被确定为关键质量属性(cqa)(li等人,impact ofphysiologically based pharmacokinetics,population pharmacokinetics andpharmacokinetics/pharmacodynamics in the development of antibody-drugconjugates.the journal of clinical pharmacology.2020,60,105-119)。因此，除了对与mab生物药物通常进行表征的蛋白质序列和翻译后修饰(ptm)之外，adc还需要表征这些载药种类的分析挑战。2、多种分析方法可以确定adc的整体dar，包括疏水相互作用色谱(hic)((bobály等人,optimization of non-linear gradient in hydrophobic interactionchromatography for the analytical characterization of antibody-drugconjugates.journal of chromatography a.2017,1481,82-91)、亲水相互作用层析(hilic)(d’atri等人,characterization of an antibody-drug conjugate byhydrophilic interaction chromatography coupled to mass spectrometry.journalof chromatography b.2018,1080,37-41)、毛细管凝胶电泳(cge)(lechner等人,insightsfrom capillary electrophoresis approaches for characterization of monoclonalantibodies and antibody drug conjugates in the period 2016–2018.journal ofchromatography b.2019,1122-1123,1-170)、以及天然和亚单位液相色谱质谱(lc-ms)(zhu等人,current lc-ms-based strategies for characterization andquantification of antibody-drug conjugates.journal of pharmaceuticalanalysis.2020,10,209-220)。这些方法还可以提供有关缀合位点位置的定性信息；然而，位点特异性缀合水平已经难以评估。3、酶消化物的液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)分析(肽图谱)是一种广泛使用的分析方法，该方法通过在肽的天然形式和修饰形式之间进行相对定量来表征蛋白质序列并量化生物药物的翻译后修饰(ptm)。由于天然肽和缀合肽之间的相对较大的质量和保留时间差异(这由于添加了疏水性药物有效负载)，因此mmaf缀合肽使该方法变得复杂。这些差异导致肽对具有截然不同的电离效率，这使得它们之间的相对定量不合适。4、因此，大多数adc肽图谱应用本质上通过仅确认缀合位点位置来定性，但很少描述量化这些位点处的缀合水平的尝试。q.luo等人(structural characterization of amonoclonal antibody–maytansinoid immunoconjugate.analytical chemistry.2016,88,695-702)描述的一种方法涉及分析未缀合的mab中间样品以及adc样品。将mab样品中检测到的未缀合峰面积与adc样品中的峰面积进行比较，并且任何面积的损失均归因于该肽位点处的缀合。然而，该方法无法归一化mab样品和adc样品之间的样品制备变异，并且无法解释单个肽上的多个缀合位点，诸如半胱氨酸缀合的adc的重链铰链肽。5、l.chen等人(in-depth structural characterization of (ado-trastuzumab emtansine)and its biosimilar candidate.mabs.2016,8,1210-1223)描述的另一种方法尝试通过将缀合肽峰面积归一化为已知的添加肽亮氨酸脑啡肽的峰面积来校正样品制备的可变性。然而，该方法仅提供样品之间的相对缀合定量，而不提供给定缀合位点的真实位点占用百分比。6、h.sang等人(conjugation site analysis of antibody-drug-conjugates(adcs)by signature ion fingerprinting and normalized area quantitationapproach using nano-liquid chromatography coupled to high resolution massspectrometry.analytica chimica acta.2017,955,67-78)描述的第三种方法尝试通过将缀合肽的峰面积与其各自的未缀合肽的肽的峰面积归一化来解释电离差异。然后将该比率乘以相对电离强度因子，该相对电离强度因子通过除以未缀合肽和缀合肽校准曲线的斜率来计算，以产生归一化比率。然后将位点缀合水平计算为该归一化比率的函数。然而，该方法需要分析标准品来构建所有缀合位点肽对的校准曲线。此外，如所述的缀合水平方程没有解释单个肽上的多个缀合位点。7、稳定同位素标记(sil)是将重同位素原子掺入感兴趣的分析物中的过程，其导致质量变化，然后可以通过质谱法检测到质量变化。sil肽图谱是蛋白质组学的领域中的一种流行方法，其提供差异化标记的样品中的蛋白质的相对定量(liu等人,advances andapplications of stable isotope labeling-based methods for proteome relativequantitation.trends in anal.chem.2020,124,115815)，但还已经应用于蛋白质ptm表征。liu等人(accurate determination of protein methionine oxidation by stableisotope labeling and lc-ms analysis.anal.chem.2013,85,11705-11709)通过将mab样品与氧-18过氧化氢反应以完全氧化感兴趣的甲硫氨酸来调查甲硫氨酸氧化水平。然后使用同位素峰面积对氧化肽的天然(+16da)和sil(+18da)形式进行相对定量。8、因此，本领域中有提供用于adc的改进的分析方法的需要。技术实现思路1、根据本公开的第一方面，提供了方法(例如，分析方法)，其包括：2、(i)使用含有羰基的同位素标记的细胞毒素和还原剂来缀合半胱氨酸缀合的抗体药物缀合物(adc)的未占据的半胱氨酸位点以产生同位素标记的adc样品；和3、(ii)对样品进行肽图谱。4、根据本公开的进一步的方面，提供了组合物，其包含与细胞毒性剂缀合以形成抗体药物缀合物(adc)的抗bcma抗体，其中抗体包含以下：包含根据seq id no:1的氨基酸序列的cdrh1；包含根据seq id no:2的氨基酸序列的cdrh2；包含根据seq id no:3的氨基酸序列的cdrh3；包含根据seq id no:4的氨基酸序列的cdrl1；包含根据seq id no:5的氨基酸序列的cdrl2；包含根据seq id no:6的氨基酸序列的cdrl3；其中细胞毒性剂是mmaf或mmae；并且其中lc c214处的百分比载药在约56％至约80％之间，hc c224处的百分比载药在约58％至约81％之间，hc铰链dl2在hc c230和hc c233处的百分比载药在约15％至约46％之间，和/或hc铰链dl1在hc c230或hc c233处的百分比载药在约11％至约15％之间。5、根据本公开的进一步的方面，提供了药物组合物，其包含如本文所述的组合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。6、根据本公开的进一步的方面，提供了包含如本文所述的药物组合物的配制剂，该药物组合物包含约20mg/ml至约60mg/ml的adc、约10mm至约30mm的柠檬酸盐缓冲液、约120mm至约240mm的海藻糖、约0.01mm至约0.1mm的edta、约0.01％至约0.05％的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80、约5.9至约6.5的ph。7、根据本公开的进一步的方面，提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如本文所公开的组合物或配制剂。8、根据本公开的进一步的方面，提供了用于治疗癌症的如本文所公开的组合物或配制剂。9、根据本公开的进一步的方面，提供了如本文所公开的组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。10、根据本公开的进一步的方面，提供了确定半胱氨酸缀合的抗体药物缀合物的缀合水平的方法，其包括：还原抗体药物缀合物以形成还原的抗体药物缀合物；将还原的抗体药物缀合物与同位素标记的细胞毒素缀合以形成同位素标记的抗体药物缀合物；从同位素标记的抗体药物缀合物产生同位素标记的缀合肽并对同位素标记的缀合肽进行肽图谱；检测同位素标记的缀合肽的质荷比；和比较同位素标记的缀合肽的质荷比与非同位素标记的缀合肽的质荷比以确定半胱氨酸缀合的抗体药物缀合物的缀合水平。在实施方案中，细胞毒素是mmaf或mmae。在另一个实施方案中，半胱氨酸缀合的抗体药物缀合物首先通过还原剂还原，然后与同位素标记的细胞毒素缀合。在实施方案中，还原剂是二硫苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep)。在另一个实施方案中，在肽图谱之前通过尺寸排阻色谱柱来洗脱样品来去除过量的还原剂。在又一个实施方案中，通过使半胱氨酸缀合的抗体药物缀合物与同位素标记的细胞毒素反应来发生缀合。在另一个实施方案中，在肽图谱之前通过尺寸排阻色谱柱来洗脱样品来去除过量的同位素标记的细胞毒素。在又一个实施方案中，肽图谱包括使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)分析。在一些实施方案，肽图谱包括使样品变性、还原剩余的二硫键、以及将所得游离巯基烷基化。在另一个实施方案中，肽图谱包括酶消化样品以产生同位素标记的缀合肽，并且任选地通过添加强酸来淬灭酶消化。在一些实施方案，方法包括使细胞毒素与同位素标记的水反应以产生同位素标记的细胞毒素。在另一个实施方案中，细胞毒素与同位素标记的水在乙腈中反应。在另一个实施方案中，半胱氨酸缀合的抗体药物缀合物是贝兰妥单抗莫福汀(belantamab mafodotin)。当前第1页12当前第1页12