用于基因疗法的经修饰AAV衣壳及其方法与流程

背景技术：

1、作为载体的腺相关病毒aav是单链dna细小病毒，其基因组包含rep基因和cap基因且侧接两个末端反向重复序列(itr)。rep基因从单个orf编码rep78、rep68、rep52和rep40，它们有助于aav基因组复制和病毒粒子组装。三种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)由单个cap orf产生，但是受稀有起始密码子(acg)的转录和选择性剪接的调节。因此，vp1和vp2在其c-末端具有与vp3相同的氨基酸。另外地，衣壳组装所必需的组装活化蛋白(aap)由cap基因内的框内移位orf进行编码。所有aav病毒粒子都由60个vp亚基构成，vp1:vp2:vp3的比率为1:1:10。目前，已识别出十三种aav血清型和许多变体，它们识别不同的细胞受体，从而显示不同的组织型和细胞型向性谱。各种血清型之间的aav vp3结构的比较揭示了散布有更多进化趋异区域的高度同源序列。这些氨基酸段通常指定为可变区(vr)i至ix。附带地，vr位于组装的衣壳表面处并且认为负责衣壳与细胞表面受体和其他宿主因子的相互作用。由于它们所在的位置，还预计vr对于衣壳组装不那么重要。因此，获得新型aav载体的衣壳设计的指导原则是仅修饰表面vr，同时保持骨架序列不变，以维持组装支架的完整性。

2、重组腺相关病毒(raav)是用于体内基因转移的载体，用于实施基因疗法并促进对于多种基础科学研究和临床基因疗法来说至关重要的基因转移。几个特征使得raav作为基因递送媒介物(vehicle)有吸引力：(i)它们提供长期转基因表达，(ii)它们与任何已知人疾病无关，(iii)它们引发相对较弱的免疫反应，(iv)它们能够转导多种分裂和非分裂细胞类型，和(v)raav基因组可以包装到多种病毒的衣壳、或蛋白质外壳中，这些衣壳或蛋白质外壳具有不同的转导特征和组织向性。使用raav载体的基因疗法已经在临床试验中取得成功，包括治疗莱伯氏先天性黑朦(leber’scongenital amaurosis(lca))、脊髓性肌萎缩(sma)和脂蛋白脂酶缺乏症。此外，基于raav基因的疗法已经在临床前模型中在包括雷特氏综合征(rett syndrome)、先天性als、帕金森病、亨廷顿病在内的多种疾病中取得成功。

3、尽管现有的aav载体构成了有价值的基因递送工具，但仍然强烈需要开发改善的aav。由于缺乏可以有效转导某些困难细胞类型或组织的衣壳血清型，限制了raav在疾病治疗和科学研究中的成功应用。并且，始终需要具有更高转导效率的aav载体来帮助患者以最低的药物剂量获得期望的治疗效果。

技术实现思路

1、本发明的一个方面提供经修饰腺相关病毒(maav)衣壳蛋白，其包含seq id no:4的重靶向肽，所述重靶向肽被插入和/或取代在野生型腺相关病毒(aav)衣壳蛋白的gh环的亚结构域iv-viii中的任何一个处的所述野生型aav衣壳蛋白的一个或多个残基。

2、在某些实施方式中，所述重靶向肽被插入和/或取代gh环的亚结构域viii中的所述一个或多个残基。

3、在某些实施方式中，所述重靶向肽被插入并取代与野生型aav9 vp1衣壳蛋白残基a587和q588相对应的两个残基。

4、在某些实施方式中，所述重靶向肽包含seq id no:1的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

5、在某些实施方式中，所述重靶向肽包含seq id no:2的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

6、在某些实施方式中，所述重靶向肽包含seq id no:3的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

7、在某些实施方式中，所述野生型腺相关病毒(aav)衣壳蛋白是aav9 vp1、aav9vp2、或aav9 vp3。

8、在某些实施方式中，所述maav衣壳蛋白进一步包含除了引入的重靶向肽以外的一个或多个额外突变。

9、本发明的另一方面提供经修饰腺相关病毒(maav)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含seq id no:25的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

10、本发明的另一方面提供经修饰腺相关病毒(maav)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含seq id no:26的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

11、本发明的另一方面提供经修饰腺相关病毒(maav)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含seq id no:27的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

12、本发明的另一方面提供重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，其包含被包封在包含本发明maav衣壳蛋白的衣壳壳体内的多核苷酸。

13、在某些实施方式中，所述多核苷酸包含感兴趣的基因(goi)，其侧接5’itr、3’itr、或二者。

14、在某些实施方式中，所述感兴趣的基因(goi)是(a)编码营养因子、生长因子、或可溶性蛋白的核酸序列；(b)恢复在该基因中携带一个或多个遗传突变的人或动物的蛋白质功能的cdna；(c)编码可以用于控制或改变细胞的活性或状态的蛋白质的cdna；(d)编码用于评估细胞状态的蛋白质或核酸的cdna；(e)用于执行基因组工程化的cdna和/或相关指导rna；(f)通过同源重组用于基因组编辑的序列；(g)编码治疗性rna的dna序列；(h)shrna或人工mirna递送系统；和/或(i)影响内源性基因剪接的dna序列。

15、在某些实施方式中，所述感兴趣的基因是：rpe65、rep1、lrat、grp143、tyr、best1、mertk、myo7a、adam9、rgr、rs1、cep290、rpgr、bbs4、ush2d、rpgrip、tulp1、crb1、gucy2d、aipl1、crx、abca4、pde6b、rho、prph2、nr2e3、nrl、cnga3、cngb3、gnat2、pde6c、rlbp1、nd4、或拮抗其功能/表达的药剂。

16、在某些实施方式中，所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，所述转录调控盒包含启动子，例如组成型启动子、或视网膜特异性启动子(例如，来自gfap、rlbp1、prob2、人rho、rhok、grk1、人蓝视蛋白hb570、人蓝视蛋白hb569、pr0.5、pr1.7、pr2.1、3lcr-pr0.5、hirbp、irbpe/gnat2、car/arr3、crx2kb、proa1、proa4、proc1、mgrm6、prob4、cabp5、人红视蛋白、g1.7p、hrpe65p、na65p、vmd2、或rs1的启动子)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述视网膜特异性启动子转录的增强子。

17、在某些实施方式中，所述感兴趣的基因是：载脂蛋白e(apoe)、apoe2、运动神经元存活基因1(smn1)、酸性α-葡萄糖苷酶(gaa)、battenin、天冬氨酸酰酶蛋白质(aspa)、芳香族l-氨基酸脱羧酶(aadc)、溶酶体三肽基肽酶i(tpp1)、溶酶体酸性β-半乳糖苷酶(βgal)、n-磺氨基葡糖磺基氢化酶(sgsh)、α-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶(naglu)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids)、npc1、弗里德赖希共济失调蛋白(frataxin)(fxn)、巨轴突蛋白(gigaxonin)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(gdnf)、cln6跨膜er蛋白、α-l-艾杜糖醛酸酶(idua)、葡萄糖神经酰胺酶1(gba1)、神经秩蛋白(neurturin)、颗粒蛋白前体(grn)、甲基化cpg结合蛋白2(mecp2)、芳基硫酸酯酶a(arsa)、白血病抑制因子(lif)、睫状神经营养因子(cntf)、或拮抗其功能/表达的药剂。

18、在某些实施方式中，所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，例如组成型启动子、或cns特异性启动子(例如，来自syn1、nse、gfap、mag、mbp、f4/80、cd68、pag、vglut、或gad的启动子)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述cns特异性启动子转录的增强子。

19、在某些实施方式中，所述感兴趣的基因是：actg1、bsnd、cdh23、col11a2、dspp、gja1、gjb2、gjb6、kcnq4、mt-ts1、myh9、myo7a、pou3f4、prps1、slc26a4、strc、tbc1d24、tecta、wfs1、adcy1、bdp1、cabp2、ccdc50、ceacam16、cib2、cldn14、clic5、coch、col4a6、crym、dcdc2、diablo、diaph1、elmod3、eps8、espn、esrrb、eya4、gipc3、gpsm2、grhl2、grxcr1、grxcr2、gsdme、hgf、homer2、ildr1、kars1、lhfpl5、loxhd1、lrtomt、marveld2、met、mir96、msrb3、mt-co1、mt-rnr1、myh14、myo15a、myo3a、myo6、nars2、osbpl2、otoa、otof、otog、otogl、p2rx2、pcdh15、pjvk、pnpt1、pou4f3、ptprq、rdx、ripor2、serpinb6、slc17a8、slc26a5、smpx、syne4、tjp2、tmc1、tmem132e、tmie、tmprss3、tnc、tprn、triobp、tspear、ush1c、及whrn、或拮抗其功能/表达的药剂。

20、在某些实施方式中，所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，所述转录调控盒包含启动子，例如组成型启动子、或毛细胞特异性启动子(例如，myo15启动子、肌凝蛋白7a(myo7a)启动子、肌凝蛋白6(myo6)启动子、pou 4类同源盒3(pou4f3)启动子、otof启动子、fgf8启动子、vglut3启动子、其突变体、截短体或衍生物)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述毛细胞特异性启动子转录的增强子。

21、在某些实施方式中，所述被包封的多核苷酸进一步包含：1)增强子；2)促进goi表达的内含子或外显子；3)wpre序列；4)5’utr编码序列；5)3’utr编码序列；6)mirna脱靶序列；和/或7)聚a信号序列。

22、本发明的另一方面提供多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的经修饰腺相关病毒(maav)衣壳蛋白、与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸序列。

23、在某些实施方式中，所述多核苷酸经密码子优化用于哺乳动物表达。

24、本发明的另一方面提供载体，所述载体包含本发明的多核苷酸。

25、在某些实施方式中，所述载体是质粒或病毒载体(例如，hsv或杆状病毒载体)。

26、本发明的另一方面提供宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的经修饰腺相关病毒(maav)衣壳蛋白、本发明的raav病毒颗粒、本发明的多核苷酸、或本发明的载体。

27、本发明的另一方面提供药物组合物，所述药物组合物包含本发明的经修饰腺相关病毒(maav)衣壳蛋白、本发明的raav病毒颗粒、本发明的多核苷酸、或本发明的载体。

28、本发明的另一方面提供在有需要的受试者中治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明raav。

29、在某些实施方式中，当与具有野生型aav9衣壳的其他方面相同的参考raav病毒颗粒相比时，所述raav病毒颗粒的感兴趣的基因优先在视网膜细胞中表达。

30、在某些实施方式中，所述视网膜细胞选自：光感受器(例如，视杆细胞；视锥细胞)、视网膜神经节细胞(rgc)、米勒细胞(muller cell)(米勒神经胶质细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、或视网膜色素上皮(rpe)细胞。

31、在某些实施方式中，所述眼部疾病或病症是选自以下中的一种或多种：干眼综合征(例如，des、慢性干眼症、干燥性角膜炎；干眼症；干性角结膜炎)、干燥综合征(sjogren'ssyndrome)、葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎(虹膜炎)、脉络膜视网膜炎、后葡萄膜炎、结膜炎、过敏性结膜炎、角膜炎、角膜结膜炎、春季角膜结膜炎(vkc)、特应性角膜结膜炎、全身性免疫介导的疾病(例如瘢痕性结膜炎及眼表的其他自身免疫紊乱)、睑缘炎、巩膜炎、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration(amd))、糖尿病视网膜病变(dr)、糖尿病黄斑水肿(dme)、眼部新生血管、老年性黄斑变性(age-related maculardegeneration(armd))、增殖性玻璃体视网膜病变(pvr)、巨细胞病毒(cmv)视网膜炎、视神经炎、球后视神经炎、及黄斑皱褶。

32、本发明的另一方面提供在有需要的受试者中治疗中枢神经系统(cns)疾病或紊乱的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明raav。

33、在某些实施方式中，当与具有野生型aav9衣壳的其他方面相同的参考raav病毒颗粒相比时，所述raav病毒颗粒的感兴趣的基因优先在cns细胞中表达。

34、在某些实施方式中，所述cns细胞选自：神经元、神经胶质细胞、及血管细胞。

35、在某些实施方式中，所述cns疾病或紊乱选自：脑或脊髓损伤、贝耳氏麻痹(bell'spalsy)、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、外周神经病变、格林-巴利综合征(guillain-barrésyndrome)、头痛、癫痫、眩晕、及神经痛。

36、本发明的另一方面提供产生raav的方法，其中所述raav包含本发明的maav衣壳蛋白，所述方法包括将编码感兴趣的基因的raav载体引入到表达本发明maav衣壳蛋白的生产或包装细胞系中。

37、在某些实施方式中，所述生产或包装细胞系经编码本发明maav衣壳蛋白的载体感染。

38、在某些实施方式中，所述生产或包装细胞系是hek293、hek293t、a549、sf9(昆虫细胞)、或海拉细胞(hela cell)。

39、本发明的另一方面提供重靶向肽，所述重靶向肽包含seq id no:4(例如，seq idno:1-3中的任何一个)、基本上由其组成、或由其组成。

40、在某些实施方式中，当重靶向肽引入aav9的vp1、vp2、和/或vp3衣壳蛋白的gh环的亚结构域viii中时，所述重靶向肽赋予对视网膜组织/细胞及cns的向性。

41、本发明的另一方面提供在有需要的受试者中治疗听觉疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明raav病毒颗粒。

42、在某些实施方式中，与具有野生型aav9衣壳的其他方面相同的参考raav病毒颗粒相比，所述raav病毒颗粒的感兴趣的基因优先在毛细胞中表达。

43、在某些实施方式中，所述毛细胞选自：内毛细胞，例如顶圈、中圈、或底圈内毛细胞；及外毛细胞，例如顶圈、中圈、或底圈外毛细胞。

44、在某些实施方式中，所述听觉疾病或病症是与选自以下的一种或多种基因相关联的听觉疾病或病症：actg1、bsnd、cdh23、col11a2、dspp、gja1、gjb2、gjb6、kcnq4、mt-ts1、myh9、myo7a、pou3f4、prps1、slc26a4、strc、tbc1d24、tecta、wfs1、adcy1、bdp1、cabp2、ccdc50、ceacam16、cib2、cldn14、clic5、coch、col4a6、crym、dcdc2、diablo、diaph1、elmod3、eps8、espn、esrrb、eya4、gipc3、gpsm2、grhl2、grxcr1、grxcr2、gsdme、hgf、homer2、ildr1、kars1、lhfpl5、loxhd1、lrtomt、marveld2、met、mir96、msrb3、mt-co1、mt-rnr1、myh14、myo15a、myo3a、myo6、nars2、osbpl2、otoa、otof、otog、otogl、p2rx2、pcdh15、pjvk、pnpt1、pou4f3、ptprq、rdx、ripor2、serpinb6、slc17a8、slc26a5、smpx、syne4、tjp2、tmc1、tmem132e、tmie、tmprss3、tnc、tprn、triobp、tspear、ush1c、及whrn。

45、在某些实施方式中，所述听觉疾病或病症是与gjb2、myo6、或otof相关联的听觉疾病或病症。

46、应理解，本文描述的本发明的任何一个实施方式，包括仅在实施例或权利要求中描述的那些实施方式，可以与本发明的任何一个或多个实施方式组合，除非明确否认或认为不当。