基于A137R基因缺失的新型非洲猪瘟减毒活疫苗的开发的制作方法

发明领域本公开提供了重组非洲猪瘟病毒(asfv)减毒活疫苗的构建细节，该疫苗用于预防由各种asfv毒株，例如高毒性的georgia 2007分离株(“asfv-g”)，引起的非洲猪瘟(asf)。一种示例性疫苗包含asfv-gδa137r修饰的病毒，这是一种通过删除a137r orf的一部分而使a137r基因失去功能而修饰的重组asfv-g。

背景技术：

0、背景

1、非洲猪瘟(asf)是猪的一种传染性病毒疾病。病原体非洲猪瘟病毒(asfv)是一种含有约190kb碱基对的双链dna基因组的大型包膜病毒。asfv与其他大型双链dna病毒(包括痘病毒科(poxviridae)、虹彩病毒科(lridoviridae)和藻类去氧核糖核酸病毒科(phycodnaviridae)共享基因组结构和复制策略(costard et al,phil.trans.royalsoc.b,(2009)364:2683-96)。asfv在家猪中的感染通常是致命的，其特征为发烧、出血、共济失调和严重抑郁。然而，感染的过程各异，其范围从高度致死到亚临床，具体取决于宿主特征和特定病毒株(tulman et al,curr.top.microbial.lmmunol.(2009)328:43-87)。

2、目前，这种疾病在二十多个撒哈拉以南的非洲国家流行。在欧洲，asf在撒丁岛(意大利)仍然流行。自2007年以来，高加索地区已宣布出现新一轮爆发，影响到格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯。最近在乌克兰、白俄罗斯、立陶宛、拉脱维亚和波兰已经报道了疫情爆发，同时影响了野猪和养猪场。在2018-2019年间，asf传播到中国，迅速蔓延到东南亚，包括蒙古、越南、泰国、东帝汶、柬埔寨、菲律宾、韩国、朝鲜，在野猪和家猪养殖场中都有传播。2020年，asf也传播到德国的野猪种群中，目前仅影响该国的一小部分控制区。近期asf的爆发带来了进一步传播到邻国的风险。亲本流行病毒asfv georgia 2007/1属于基因型ii的高毒性分离株(chapman et al,emerging infect.dis.(2011)17:599-605)，它是造成亚洲和欧洲当前所有疫情爆发的原因，爆发病毒与亲本毒株具有90％或更高的相似度。

3、目前，尚无可用于asf的商业疫苗，疫情爆发主要通过动物检疫和屠宰来控制。人们尝试使用感染的细胞提取物、感染的猪外周血白细胞的上清液、纯化和灭活的病毒体、感染的戊二醛固定的巨噬细胞或用洗涤剂处理的感染的肺泡巨噬细胞来给动物接种疫苗，均未能诱导保护性免疫(coggins,l.,prag.med.viral.(1974)18:48-63；forman et al,arch.viral.,(1982)74:91-100；kihm et al,(1987)in:african swine fever,becker,y.(ed),martinus nijhoff,boston,pp 127-44；mebus,c.a.,adv.virus res.,(1988)35:251-69)。在病毒感染后存活的猪中确实会产生同源保护性免疫。经历asfv的中等毒性或减毒变体急性感染后存活的猪会对同源病毒攻击产生长期抗性，但很少对异源病毒攻击产生长期抗性(hamdy and dardiri,am.j.vet.res.(1984)45:711-14；ruiz-gonzalvo et al,(1981)in:fao/cec expert consultation in asf research,wilkinson,p.j.(ed),rome,pp 206-16)。在本文中，我们报道了重组疫苗的开发，其中从asfv-g基因组中删除了a137r基因的一部分。用这种病毒给猪接种疫苗可以防止猪患asf。由于目前没有可用的asfv疫苗，因此，开发任何能诱导预防该疾病致命表现的疫苗都极具价值。

4、发明概述

5、本公开提供了一种转基因的病毒，其中，病毒基因组与seq id no:2至少99％的相同。在一些情况下，病毒基因组与seq id no:2至少99.8％相同。在其他情况下，病毒基因组与seq id no:2相同。

6、本公开还提供了一种抗非洲猪瘟病毒(asfv)的疫苗组合物，其包含转基因的病毒，该转基因的病毒具有与seq id no:2至少99％相同的病毒基因组。在具体实施方案中，asfv为asfv-georgia 2007分离株(asfv-g)。

7、本文还提供了一种保护猪免于asfv感染的方法，包括向猪施用有效保护猪免于临床asfv疾病的量的包含转基因的病毒的减毒活疫苗，其中病毒具有与seq id no:2至少99％相同的病毒基因组。在具体实施方案中，asfv为asfv-georgia 2007分离株(asfv-g)。在另一实施方案中，有效保护该猪免于临床asfv疾病的量为包含102-106had50的转基因的病毒的疫苗。

8、本公开还提供了重组asfv突变病毒，其包含在a137r开放阅读框中或在控制a137r蛋白表达的调节元件中的合成突变，从而产生非功能性的基因组a137r基因。在一具体实施方案中，合成突变为导致seq id no:1的第55531位和第55779位之间的一个或多个核苷酸缺失的缺失突变。在另一实施方案中，合成突变为seq id no:1的第55531位和第55779位之间的一个或多个核苷酸的移码突变、插入突变或无义突变。在一些实施方案中，突变的asfv为asfv-georgia分离株。在一些实施方案中，突变asfv包含与seq id no:2至少95％相同或至少99％相同的基因组。本文进一步提供了一种抗asfv-g的疫苗组合物，其包含本段所述的重组病毒。

9、本公开还提供了一种用于保护猪免于asfv的方法，包括向猪施用有效保护该猪免于临床asfv疾病的量的包含重组asfv突变病毒的减毒活疫苗，该重组asfv突变病毒包含在a137r开放阅读框中或在控制a137r蛋白表达的调节元件中的合成突变，从而产生非功能性的基因组a137r基因。在具体的实施方案中，asfv为asfv-g。在另一实施方案中，有效保护该猪免于临床asfv疾病的量为包含至少102had50的转基因的病毒的疫苗。

10、引用合并

11、本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请，均通过引用并入本文，其程度如同每篇单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指明通过引用并入本文。

技术实现思路

1、非洲猪瘟病毒(asfv)是家猪的具有传染性且通常致死的病毒疾病的病原体，其对养猪业造成重大经济影响。由于缺少疫苗，非洲猪瘟(asf)的控制受到阻碍。之前已经报道了源自天然存在的、细胞培养适应的或转基因的减毒活asfv的实验疫苗。然而，这些疫苗均未被开发投入商用。在本文，我们报道了从高毒性的asfv分离株georgia分离株(asfv-g)中删除之前未表征的基因a137r使得其在猪中完全减毒的发现。肌肉内接种(im)缺乏功能性a137r基因(例如本文描述的特异性asfv-g-δa137r突变体)的病毒的动物，在28天的观察期内临床上保持正常。重要的是，asfv-g-δa137r感染的动物在受到致病亲本毒株asfv-g攻毒时得到了保护。

2、本文示出并描述了本发明的优选实施例。对于本领域的技术人员来说显而易见的是，此类实施例仅作为示例提供。本领域的技术人员在不偏离本发明的情况下，可进行许多变化、更改和替换。在实践本发明时，可以采用本文所描述的本发明实施例的各种替代方案。所包括的权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求及其等同形式的范围内的方法和结构。

3、除非另有定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。本文参考了本领域技术人员已知的各种材料和方法。阐述重组dna技术一般原理的标准参考文献包括：sambrook et al.,“molecular cloning:alaboratory manual”,2d ed.,cold spring harbor laboratory press,plainview,n.y.,1989；kaufman etal.,eds.,“handbook of molecular and cellular methods in biology andmedicine”,crc press,boca raton,1995；and mcpherson,ed.,“directed mutagenesis:apractical approach”,irl press,oxford,1991。

4、本领域技术人员已知的任何合适的材料和/或方法都可用于实施本发明。用于实施本发明的材料和/或方法已得到了描述。除非另有说明，否则在以下描述和实施例中提到的材料、试剂等可从商业来源获得。本发明教导并描述了用于产生基因改变的asfv株的方法和工具。

5、如在本说明书和权利要求书中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式的“一个”、“一种”和“该”、“所述”包括复数指代。

6、如本文所用的术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯化的”是指该材料基本上或大体上不含在其天然状态下通常伴随所提及的材料的组分。

7、术语“约”定义为所引用值的正负百分之十。例如，不论是否具体说明，“约1.0克”意指0.9克到1.1克，以及在该范围内的所有值。

8、术语“基本上由......组成的核酸”及其语法变体意指与参考核酸序列相差20个或更少的核酸残基，并且还执行参考核酸序列的功能的核酸。这类变体包括比参考核酸序列短或长的序列、在特定位置具有不同残基的序列，或二者的组合。

9、术语“佐剂”意指非特异性地增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可以包括矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液，抗原被吸附于其上；或者油包水乳液，其中，抗原溶液在矿物油中乳化(例如，弗氏不完全佐剂)，有时还包括灭活的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)，以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸也可用作佐剂(例如，参见美国专利号6194388；6207646、6214806、6218371、6239116、6339068、6406705和6429199)。佐剂还包括生物分子，例如，共刺激分子。

10、术语“给药”/“施用”意指通过任何有效途径向受试者提供物质(例如，治疗剂)的任何方法。示例性的施用途径包括但不限于注射(例如，皮下、肌肉内、皮内、腹膜内和静脉内)、口服、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。

11、如本文所用，术语“编码序列”和“编码区域”是指编码用于合成rna、蛋白质，或rna或蛋白质的任意部分的遗传信息的核苷酸序列和核酸序列，包括rna和dna。

12、本文所提供的术语组合物的“有效量”是指能够执行其表达的特定功能的组合物的量。所需的确切量可能因组合物和功能而异，这取决于如涉及的组合物和方法等公认的变量。有效量可以在一次或多次应用中递送。因此，无法指定确切的量，然而，熟练的技术人员可以通过常规实验来确定适当的“有效量”。

13、术语“a137r”、“asfv a137r”和“基因组a137r”为同义词，是指在本文定义为seqid no:3的基因，或具有碱基置换的seq id no:3的任何形式，这些碱基置换导致蛋白质具有与seq id no:4相同的序列。在适当的上下文中，这些术语也可以指这些seq id no的修饰形式，例如，包含缺失、插入和其他重组修饰的形式。asfv-g开放阅读框a137r编码由137个氨基酸组成的蛋白质(seq id no:4)，且定位于seq id no:1(野生型asfg，本文测序；另见genbank登记号fr682468.2)的核苷酸第55531位和第55944位之间的反义链上。

14、在本发明的上下文中，术语“非功能性基因组a137r”是指位于asfv基因组中的经修饰的a137r基因，其中与未修饰的功能性asfv a137r基因相比，asfv a137r基因的此类修饰根本不产生asfv a137r基因产物，也不产生生物学上非功能性asfv a137r基因产物。此类修饰可以包括但不限于编码序列的全部或部分缺失、开放阅读框的破坏(例如，通过插入框移突变或插入无义密码子)、上游或下游调节元件的修饰，以及/或任何目前已知或可想象的使此类asfv il17l基因的功能表达失活或敲除的方法。

15、术语“免疫”意指例如通过接种疫苗使受试者免受感染性疾病侵害。

16、对于本发明而言，以百分比表示的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”是指两个最佳比对序列中具有相同残基的位置数(乘以100)除以比较的位置数。空位，即在比对中残基存在于一个序列中而不存在于另一个序列中的位置，其被视为具有非相同残基的位置。两个序列的比对是通过needleman和wunsch算法执行的(needleman和wunsch，jmol biol，(1970)48:3,443-53)。可以使用标准软件程序(例如gap，它是wisconsinpackage version 10.1的一部分(genetics computer group，madison,wisconsin,usa))方便地进行计算机辅助序列比对，使用默认评分矩阵，空位产生罚分为50，空位延长罚分为3。

17、在两个多核苷酸或多肽的上下文中，短语“高百分比相似”或“高百分比同一性”及其语法变体，是指两个或多个序列或子序列在与最大对应序列比较和比对时，至少具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的核苷酸或氨基酸同一性，这是通过使用序列比较算法或通过目视检查来测量的。在一个示例性实施方案中，序列在多核苷酸或多肽序列的整个长度上都具有高百分比同一性。

18、术语“猪”通常指猪科(suidae)的任何成员，包括家猪、野猪、肉猪和公猪。

19、“疫苗”在本文中被定义为能在接种动物体内产生保护性应答，但不会引起严重疾病的生物制剂。疫苗的施用导致对疾病的免疫。因此，疫苗刺激抗体产生或抵抗致病病原体(例如asfv)的细胞免疫力。免疫力在本文被定义为：与未接种疫苗的群体相比，在猪群体中接种疫苗后诱导针对致死性和临床症状的明显更高水平的保护，具体地，本发明的疫苗可以保护大多数接种动物免受疾病的临床症状和致死性侵害。本公开的疫苗通常是基因工程化(重组)的突变病毒疫苗。

20、在本公开的上下文中，术语“复制非缺陷型”是指非天然存在的重组asfv，该病毒能够在体外和/或体内复制，并且/或能够产生病毒后代，尽管这种复制和/或病毒后代产生可能与未经修饰的亲本毒株相比也有所减少。因此，此类asfv在体外(例如，在细胞培养物中)的复制是非缺陷的；但在哺乳动物体内，此类asfv在其复制中至少部分地受损，例如，导致复制和/或病毒后代的产生低于检测限。

21、如本文所用，术语“最小剂量”或“最小有效剂量”是指对受体表现出无毒性或毒性最小的剂量，但该剂量仍能产生预期的结果(例如，保护性免疫力)。

22、病毒/疫苗

23、本文提供了一种新型突变asfv-gδa137r(seq id no:2)，该病毒通过重组删除亲本asfv-g基因组(seq id no:1)的a137r基因(seq id no:3)的一部分而产生。本文描述了特异性重组突变asfv-gδa137r的基因组核苷酸序列(seq id no:2)，其与编码亲本asfv-g的基因组核苷酸序列(seq id no:1)不同。137个氨基酸的asfv-g a137r编码的蛋白质(seqid no:4)与由asfv-gδa137r的突变核苷酸序列编码的预测突变a137r蛋白不同。来自asfv-gδa137r的a137r蛋白(seq id no:6)预测缺乏野生型a137r蛋白的第1至85位氨基酸。由于p72mcherry表达盒插入该位置中(见实施例部分)，因此认为在该插入后剩余的编码区被转录，导致在病毒感染期间不产生功能性a137r蛋白。

24、该示例性的突变毒株(asfv-gδa137r(seq id no:2))代表其中asfv a137r基因为非功能性的重组疫苗属，包括但不限于缺失突变体、无义突变体、插入突变体、移码突变体以及其他导致a137r蛋白不表达或非功能性的a137r蛋白表达的突变体。其他设想的重组病毒包括导致a137r蛋白不表达或不翻译的调控元件中的突变体。

25、旨在排除靶蛋白(例如，a137r)的功能性表达或减少靶蛋白的表达或活性降低的修饰可以涉及编码靶蛋白的dna或基因的突变，包括删除靶基因的全部或部分，包括但不限于靶基因座的开放阅读框、转录调控因子例如靶基因座的启动子和定位于开放阅读框5'或3'端的任何其他调控核酸序列，在开放阅读框中插入提前终止密码子，以及移动阅读框导致翻译提前终止的插入或删除。此类缺失突变可以使用本领域技术人员已知的任何技术来实现。通过在编码靶蛋白的dna或基因中进行点突变或插入，也可以实现靶蛋白的水平降低或活性降低。本文所公开的核苷酸序列和基因的突变、插入和缺失变体可通过本领域技术人员熟知的方法容易地制备。用于实现靶蛋白水平降低和/或活性降低的技术可包括crispr/cas、talen和锌指核酸酶。产生功能上与本文所公开的特异性突变等同的突变、插入和缺失突变完全在本领域技术人员的技能范围内。

26、本文所描述的用于在asfv-g中创建a137r的缺失突变体的方法，可以应用于asfv的不同分离株(例如，在亚洲、欧洲或非洲流行的分离株)，这些分离株中存在功能性a137r。此类方法可以随着本领域已知的方法进行变化，例如，使用可通过纯化来选择重组病毒的不同选择标志物，例如但不限于荧光蛋白、酶(例如可与显色底物一起使用的β-葡萄糖醛酸苷酶或β-半乳糖苷酶)，以及药物选择标志物。此类方法也可用于对a137r的开放阅读框(orf)以及使控制a137r基因表达和翻译的调节元件发生任何突变，从而产生非功能性a137r蛋白。

27、本发明还涵盖了其他asfv株和基因型中a137r的突变体(及相关的毒株特异性等位基因)。本领域已知或日后发现的任何asfv均可作为构建此类合成突变的潜在平台。本发明包含了具有合成突变的asfv菌株，合成突变在与seq id no:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列中。本发明还包含了与seq id no:2具有95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高同一性的完整基因组的asfv菌株。

28、本公开还进一步考虑了将非功能性的a137r基因与其他重组突变相结合。因此，不仅野生型病毒可以按本文所公开的那样进行修饰，而且在其他基因或基因组区域中含有非天然存在的突变的病毒株也可被修饰(参见例如美国专利9814771)。

29、本公开提供了此类合理设计的减毒活asfv-gδa137r，其可掺入到免疫原性组合物中，以制备当用asfv-g攻毒时有效保护动物(例如，猪)免于临床asf疾病的疫苗。因此，本发明的一个目的是提供一种用于通过施用有效量的合理设计的减毒活asfv-gδa137r疫苗来保护动物免于asfv-g的方法。在另一种实施方案中，本公开提供了一种在动物中，优选猪科(suidae)(例如，家猪(sus scrofa domesticus)、野猪(sus scrofa scrofa)、疣猪(potamochoerus porcus)、假面野猪(potamochoerus larvatus)、大林猪(hylochoerusmeinertzhageni)以及野生猪)动物中诱导保护性免疫应答的方法，此类方法通常包括向此类动物施用本文所述的一种或多种asfv免疫原性组合物和疫苗。

30、本公开的另一个目的是提供一种区分感染野生型asfv的动物和接种本文所述的重组病毒疫苗的动物的方法。此类用于区分感染动物和接种疫苗动物(diva)的方法可通过血清学测试来完成，该测试能检测野生型a137r蛋白和突变a137r蛋白之间的差异。可选地，此类方法可包括基因筛选方法，例如，pcr扩增和基于不同产物的检测。通常，此类方法使用一个或多个引物组，这些引物组位于突变位点的两侧并扩增相同的区域，从而产生不同长度或序列的产物。

31、本发明中的免疫原性组合物，无论包含哪些其他组分，都包含具有非功能性a137r基因/蛋白的重组asfv。本发明的a137r蛋白可以包含seq id no:4的全部序列，以及与seqid no:4蛋白具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白。

32、本文所公开的免疫原性组合物的免疫原性有效量可以根据多种参数而变化。然而，一般而言，对于肌肉施用的每剂量单位的有效量可为约102的50％血细胞吸附剂量(“had50”)至106的had50。在实践本发明的方法时，可以使用一个、两个或更多剂量单位。本领域技术人员可以容易地修改剂量单位以适应所需的体积或质量。无论剂量单位参数如何，本文所公开的免疫原性组合物都可以使用有效产生免疫应答的量进行施用。

33、本文所公开的疫苗中活性成分的剂量水平可以由本领域技术人员改变，以在受试者或每次应用中实现期望的结果。因此，选定的剂量水平可取决于多种因素，包括但不限于制剂、与其他治疗的联用、已有病症的严重程度以及佐剂的存在与否。在优选的实施方案中，施用免疫原性组合物的最小剂量。确定最小剂量完全在本领域技术人员的能力范围内。

34、本发明的疫苗可以通过市售可得的减毒活asfv疫苗的常规方法制备。在一具体的实施方案中，对易感底物接种asfv-gδa137r突变体并增殖直到病毒已复制到所需的滴度，之后收获含asfv-gδa137r的物质。随后，收获的物质可以制成能引发免疫原性特性的疫苗制剂。任何能够支持本文提供的重组病毒复制的底物均可用于本发明，包括猪外周血巨噬细胞或来自感染猪的血液的原代培养物。

35、制剂和施用

36、本文提供的疫苗包含活体形式的如上所定义的重组病毒中的一种重组病毒以及通常用于此类组合物的药学上可接受的载体或稀释剂。载体包括稳定剂、防腐剂和缓冲剂。适用的稳定剂包括例如spga(蔗糖、磷酸盐、谷氨酸和白蛋白)、碳水化合物(山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、谷氨酸盐和葡萄糖)、蛋白质(奶粉、血清、白蛋白、酪蛋白)或它们的降解产物。适用的缓冲剂包括例如碱金属磷酸盐。可使用的防腐剂包括但不限于硫柳汞、硫柳汞钠和庆大霉素。稀释剂包括水、水性缓冲液(例如，缓冲盐水)、醇和多元醇(例如，甘油)。

37、在一些情况下，本发明的疫苗还含有或包含一种或多种佐剂，该一种或多种佐剂包括免疫原性组合物制剂中包含的增强受体内由免疫原性组合物诱导的免疫应答的任何物质。在一些情况下，此类佐剂可以包括重组病毒所包含的蛋白质和其他成分。其他佐剂可以作为免疫原性组合物的额外组分包括在内，包括如铝盐(明矾)、油乳剂、皂甙、免疫刺激复合物(iscom)、脂质体、微粒、非离子嵌段共聚物、衍生的多糖、细胞因子和多种细菌衍生物等类别。在实践本文所公开的发明时，可以使用本领域已知的任何相关佐剂。选择佐剂的影响因素包括动物物种、特定病原体、抗原、免疫途径和所需的免疫类型并且可以由本领域技术人员容易地确定。

38、除重组病毒外，本公开的免疫原性组合物还可以包含载体。用于实践本文所提供的免疫原性组合物的载体可以是本领域已知的任何载体，且可以是液态、固态、半固态或凝胶。制剂的类型可以根据抗原的施用途径进行修改。优选地，载体对受体无毒。本领域技术人员可以容易地选择此类载体用于受体动物，例如，家禽。

39、本公开提供了免疫原性组合物，其用于将在至少含有重组病毒的组合物中缺少功能性a137r基因/蛋白的重组asfv导入靶标(例如，猪)中的免疫原性组合物。因此，本文提供的组合物可用于诱导对asfv疾病的免疫力或抵抗力。

40、本文提供的疫苗可以通过肌内、皮下、鼻内或注射的方式以有效保护动物免于asfv毒株攻毒的量施用。疫苗也可以通过口服、直接口服接种、饮用水中给药或通过诱饵递送系统施用。重组病毒的有效量可根据本领域技术人员考虑的参数而变化。有效量可以根据本文实施例中提供的任何已知方法或指导，由本领域技术人员根据需要通过实验确定。

41、正如最初描述的那样，asfv a137r基因编码137个氨基酸的蛋白质a137(alcamiet al,j.gen.virol.(1993),11:2317-24)。asfv a137r基因的翻译产物是一种在病毒复制周期晚期表达的蛋白，其电泳迁移率为11.5kd，并且已在纯化病毒的制备过程中被检测到(alejo et al,j.virol.,(2018)92:e01293-18)。这种蛋白在所有asf分离株中都高度保守。人们对a137的了解不多，只知道其在感染后期被翻译并整合到病毒体中。迄今为止，尚未对其在发病机制中的作用进行研究，也未描述突变表型。

42、在一般地描述了本发明后，通过参考某些具体实施例，可以更好地理解本发明。这些实施例被包括在本文中以进一步说明本发明并且不旨在限制如权利要求所定义的本发明的范围。

43、实施例

44、实施例1

45、细胞培养物和病毒

46、如前所述，从去纤维蛋白的猪血中制备原代猪巨噬细胞培养物(zsak et al,j.virol.,(1998)72:1028-35)。简要来说，将经肝素处理的猪血在37℃下孵育1小时，以使红细胞级分沉降。通过在ficoll-paque(pharmacia,piscataway,n.j.)密度梯度(比重为1.079)上的浮选分离单核白细胞。将单核细胞/巨噬细胞级分在含有巨噬细胞培养基的塑料primaria(falcon；becton dickinson labware,franklin lakes,n.j.)组织培养瓶中在37℃、5％ co2条件下培养48小时，该巨噬细胞培养基由含有30％的l929上清液和20％的胎牛血清(hi-fbs,thermo scientific,waltham,ma)的rpmi 1640培养基(lifetechnologies,grand island,ny)配制而成，通过使用10mm edta的磷酸盐缓冲盐水(pbs)使贴壁细胞从塑料上分离，然后以每毫升5×106细胞的密度重新接种到primaria t25、6孔或96孔培养皿中，24小时后用于检测。

47、病毒滴度在96孔板的原代猪巨噬细胞培养物中进行测定。病毒稀释和培养均使用巨噬细胞培养基进行。通过血细胞吸附(ha)评估病毒的存在情况，病毒滴度则通过reed和muench方法计算(amer.j.hygiene,(1938)27:493-497)。

48、本研究中使用的asfv georgia(asfv-g)是由来自格鲁吉亚共和国第比利斯的农业部实验室(lma)的nino vepkhvadze博士提供的现场分离株。

49、实施例2

50、构建重组asfv-gδa137r

51、重组asfv是在使用猪巨噬细胞培养物的感染和转染过程中，通过亲本asfv基因组与重组转移载体之间的顺序同源重组产生的(neilan et al,virol.,(2004)319:337-42；zsak et al,supra)。使用含有侧翼基因组区域和包含mcherry基因的报告基因盒的重组转移载体(p72mcherryδa137r)，该侧翼基因组区域包含a137r的映射到基因的左侧(1kbp)和右侧(1kbp)的部分，以及该报告基因盒含有具有asfvp72晚期基因启动子的mcherry基因。该构建体在a137r开放阅读框(orf)(氨基酸残基第1至第85位)中产生249个核苷酸的缺失(图1)。通过dna合成(epoch biosciences,bothwell,wa,usa)获得重组转移载体p72mcherryδa137r。用asfv-g感染并用p72mcherryδa137r转染巨噬细胞培养物。通过连续进行的噬斑测定纯化，将代表独立的原代噬斑的重组病毒纯化至均质。在原代猪巨噬细胞培养物的单层上进行9次连续的噬斑纯化后，获得了重组病毒。

52、实施例3

53、asfv-gδa137r相对于亲本asfv-g的全基因组序列分析

54、为了评估基因修饰的准确性和重组病毒基因组的完整性，使用下一代测序(ngs)获得了asfv-gδa137r和亲本asfv-g的全基因组序列，并进行了比较。第一步，对用于构建asfv-gδa137r突变病毒的亲本asfv-g实验室毒株和原始asfv georigia 2007/1(chapmanet al,emerg.infect.dis.,(2001)17:599-605；genbank登录号fr682468.2)的全长基因组进行了比较。从被感染细胞的细胞质中使用trizol方法(life technologies,grandisland,ny,usa)提取asfv dna。dna浓度使用dsdnahs检测试剂盒(lifetechnologies)测定，并在2荧光测定仪(life technologies)上读数。简而言之，通过酶促反应剪切病毒dna，评估片段大小分布，然后将识别条形码的接头序列连接到dna片段上。使用pippin preptm(sage science,beverly,ma)收集所需大小范围的文库，并归一化处理。随后，我们使用该dna文库按照制造商的方案使用nextseq(illumnia,san diego,ca)进行了ngs测序。使用clc genomics workbench软件(clcbio,waltham,ma)进行序列分析。

55、在这两种病毒之间观察到以下差异(核苷酸位置基于asfv georgia 2007/1，genbank登录号fr682468.2提供)：(i)在第1363位处插入核苷酸a，(ii)在第19792位处缺失g，以及在第2008位处缺失gt和在第21797位处缺失g。(iii)单核苷酸变体在第98378位处和第190543位处具有从a到g的变化[在这种情况下进行标记，以及以下所有的a在此处描述的疫苗中标记，g为参考]，在第167188位处发生了从c到g的变化。第93878位位于orf b438l中，但为沉默突变，其不影响蛋白产物的氨基酸序列。第167188位处的变化将蛋白e119l的丙氨酸变为脯氨酸。这里描述的其他变化均不影响任何已知的开放阅读框(orf)，且位于基因组的非编码区域。为了确定重组病毒是否获得了来自亲本毒株的附加的遗传变化，对asfv-gδa137r和亲本asfv-g进行了全长基因组比较。asfv-gδa137r和asfv-g的dna序列组装揭示了a137r基因中对应所引入的修饰的249个核苷酸的缺失。asfv-gδa137r基因组的共有序列显示了在a137r基因中对应p72-mcherry表达盒序列(引入在靶基因中产生249个核苷酸的缺失)的3944个核苷酸的插入。除了表达盒的插入外，未观察到asfv-gδa137r和asfv-g基因组之间的其他差异。总之，asfv-gδa137r病毒在同源重组和噬斑纯化过程中未累积任何显著突变。

56、实施例4

57、评估asfv-gδa137r在猪中的毒性。

58、动物实验在piadc的生物安全3级条件下的动物设施内进行，按照由实验动物管理和使用委员会批准的方案。

59、使用80-90磅的商业品种猪评估asfv-gδa137r相对于其毒力亲本asfv-g病毒的毒力表型。五头猪分别肌肉注射(im)102单位的asfv-gδa137r或102had50的asfv-g病毒。实验过程中每天记录临床体征(食欲不振、抑郁、发热、皮肤变为紫色、蹒跚步态、腹泻和咳嗽)和体温变化。在保护实验中，动物先肌肉注射102had50，然后在28天后肌肉注射102had50的毒力型亲本asfv georgia2007株攻毒。如前所述进行与该病相关的临床体征的存在的评估。

60、所有通过肌肉注射102had50的asfv-g的猪在感染后3到4天表现出体温升高(>104°f)。猪表现出与该病相关的临床体征，包括食欲不振、抑郁、皮肤变为紫色、蹒跚步态和腹泻(表1)。疾病的体征随着时间的推移逐渐加重，动物在感染后的第7天或第9天死亡或在极端情况下被安乐死。相反，通过肌肉注射102单位asfv-gδa137r的动物在整个观察期(21天)内没有表现出任何临床疾病的体征。因此，a137r基因的缺失导致了亲本毒力型asfv-g的完全减毒。asfv-gδa137r突变体减毒的效果令人惊讶，因为我们已删除了许多功能未知的单个基因，但未观察到毒力的变化。所有模拟接种组的动物都根据相应的iacuc方案出于人道主义原因被安乐死。

61、表1.猪在感染102had50剂量的asfv-g-δa137r或亲本asfv-g后的存活率和发热反应

62、

63、实施例5

64、asfv-gδa137r对抗亲本asfv-g攻毒的保护作用

65、由于通过肌肉注射102had50 asfv-gδa137r的猪在感染后存活且没有出现疾病体征，因此接种102had50 asfv-gδa137r的动物组(n＝5)在接种后第28天肌肉注射了102had50的亲本asfv-g攻毒(同源攻毒)。采用相同途径和剂量攻毒的五只未接种的猪，作为未接种/攻毒的对照组。所有动物均肌肉注射接种102had50的asfv-gδa137r，然后在28天后肌肉注射102had50的asfv-g病毒攻毒。所有模拟接种组的动物都根据相应的iacuc方案出于人道主义原因被安乐死。接种asfv-gδa137r疫苗的所有动物在攻毒后的21天观察期内临床表现正常。

66、接种asfv-gδa137r并接受攻毒的五只动物在整个观察期(21天)内完全无症状(表2)。模拟接种/攻毒的对照组的所有动物都发病，该疾病的临床过程与接种102had50asfv-g的动物中观察到的临床过程相似(见上文)。因此，asfv-gδa137r能够在高毒力亲本病毒攻毒时诱导保护以免出现临床疾病。

67、表2.asfv-g-δa137r感染后28天，受asfv-g病毒攻毒的动物中猪的存活率和发热反应。

68、

69、总之，在本文我们呈现的证据表明，a137r基因的缺失极大地改变了asfv-g的毒力，产生了完全减毒的病毒，将其命名为asfv-gδa137r。用asfv-gδa137r免疫的动物受到保护以免受毒力型亲本asfv-g的攻毒。

70、实施例6

71、asfv-g-δa137r在猪巨噬细胞中的生长能力

72、在原代猪巨噬细胞培养物中评估了asfv-g-δa137r的体外生长特征，该原代猪巨噬细胞是asfv在猪体内感染过程中的主要靶细胞，并与亲本asfv-g在多步生长曲线中进行了比较(图2)。以0.01的moi感染细胞培养物，在感染后2、24、48、72和96小时(hpi)收集样本。结果显示，与亲本asfv-g相比，asfv-g-δa137r表现出显著降低的生长动力学。asfv-g-δa137r的产量大约是asfv-g的10-100倍，这取决于所考虑的时间点。因此，a137r基因的缺失显著降低了asfv-g-δa137r相对于亲本asfv-g分离株在原代猪巨噬细胞培养物中的体外复制的能力。

73、实施例7

74、asfv-g-δa137r感染的动物排出疫苗病毒

75、在上述示例中，不同组的五头猪通过肌肉注射102had50的asfv-g-δa137r进行感染，在这些组的每组中有模拟感染的动物作为哨兵动物共栖以检测感染动物可能的病毒排放。所有哨兵动物在临床上保持正常，尽管在哨兵动物中检测到asfv-g-δa137r的存在表明了存在病毒的排放并解释了感染后第28天asfv特异性抗体的晚期升高。

76、实施例8

77、asfv-g-δa137r感染的动物中的宿主抗体应答

78、所有感染asfv-g-δa137r的动物，无论接受病毒的剂量如何，都具有类似的高滴度循环抗asfv抗体。从接种后第11天开始在三只动物中检测到由igg同种型介导的抗体应答，在接种后第14天在四只动物中检测到，在接种后第21天在所有动物中检测到，并且在接种后第28天在所有五只动物中达到所有接种asfv-g-δa137r的动物的最高水平。因此，保护与在攻毒时抗asfv抗体的存在之间存在密切的相关性。值得一提的是，在一只哨兵动物中获得的一份血清样本中检测到了低水平的抗体(见图3)。

79、实施例9

80、诱导无菌免疫

81、使用a137r特异性实时pcr特异性检测攻毒病毒(其允许检测约10had50)，所有测试的血液样本中攻毒病毒的存在测试呈阴性。此外，在观察期结束时(攻毒后第21天)，从所有动物中获取扁桃体和脾脏样本，并通过在猪巨噬细胞培养物中的病毒分离来测试病毒的存在。每组中大多数动物的扁桃体或脾脏中显示出感染性病毒的存在(数据未显示)。然后，所有阳性样本使用a137r特异性实时pcr进行评估，仅在最初感染102had50/ml的asfv-g-δa137r的一只动物的脾脏中检测到攻毒病毒的存在。这些结果表明，接受102had50/ml asfv-g-δa137r的所有感染动物中都没有出现攻毒病毒的复制。

82、总之，接种102had50/ml asfv-g-δa137r疫苗的动物实现了无菌免疫(不允许攻毒病毒进行复制的免疫)。

83、虽然本发明已参照所示实施例的细节进行了描述，但这些细节并不旨在限制如所附权利要求书中所定义的本发明的范围。本公开的实施方案中要求保护的专属权利或特权定义如下(见权利要求书)。