用于口服递送核酸的制剂的制作方法

本发明涉及用于口服递送核酸例如治疗性rna(例如，非编码或编码rna)的制剂。在一些实施方式中，所述制剂增强了此类rna的口服生物利用度，从而以口服递送而不是通过如注射递送的来治疗各种疾病，特别是以炎症和/或纤维化为特征的疾病。

背景技术：

技术实现思路

1、在一些实施方式中，提供了用于口服递送核酸的制剂，其包含核酸、阳离子脂质、至少一种酪蛋白和壳聚糖。

2、在一些实施方式中，所述制剂中的核酸包含核糖核酸(rna)，其中所述rna以所述制剂的0.0001％至约0.01％重量/体积的量存在。在一些实施方式中，所述至少一种酪蛋白包含至少一种α-s1酪蛋白亚单元，所述α-s1酪蛋白亚单元以所述制剂的约0.25％至约7％重量/体积的量存在，所述壳聚糖以所述制剂的约0.0001％至4％重量/体积的量存在。

3、在一些实施方式中，提供了一种用于口服递送核酸的制剂，其包含多个人工脂质胶束、多个核酸、和在所述人工脂质胶束上的包衣，其中所述核酸的一部分被包封在所述人工脂质胶束内，其中所述包衣包含酪蛋白和壳聚糖聚合物的混合物。在一些实施方式中，所述核酸包含核糖核酸(rna)，并且其中所述rna以所述制剂的约0.00001％至约0.05％重量/体积的量存在，所述酪蛋白和壳聚糖聚合物的混合物包含至少一种α-s1酪蛋白亚单元，所述α-s1酪蛋白亚单元以所述制剂的约0.5％至约5％重量/体积的量存在，并且其中所述壳聚糖以所述制剂的约0.001％至约1％重量/体积的量存在。

4、在一些实施方式中，所述制剂还包含酸。在一些实施方式中，所述酸以所述制剂的约0.001％至约1％体积的量存在，并且所述酸选自乙酸、柠檬酸、磷酸和柠檬酸。在一个实施方式中，所述制剂还包含乙酸，其中所述乙酸以所述制剂的约0.01％至约1％重量/体积的量存在。

5、在一些实施方式中，所述阳离子脂质相对于每微克核酸以约0.1微升至约5微升的量存在。在一些实施方式中，所述核酸包含非编码rna、编码rna(例如mrna)或其组合。在一些实施方式中，所述壳聚糖是低分子量壳聚糖。在一些实施方式中，所述低分子量壳聚糖的质量范围为约50至约190千道尔顿。

6、在一些实施方式中，所述核酸包含非编码rna或编码rna，其中rna以所述制剂的约0.001至约0.005％重量/体积的量存在，其中至少一种酪蛋白包含α-s1酪蛋白亚单元、α-s2酪蛋白亚单元、β-酪蛋白亚单元和κ-酪蛋白亚单元的混合物，其中酪蛋白亚单元以所述制剂的约1％至3％重量/体积的量存在，并且其中壳聚糖以所述制剂的约0.01％至0.1％重量/体积的量存在。

7、在一些实施方式中，所述核酸包含非编码rna或编码rna，其中所述rna以制剂的约0.0015至约0.004％重量/体积的量存在，其中所述酪蛋白亚单元的混合物以所述制剂的约2％至3％重量/体积的量存在，其中所述壳聚糖以所述制剂的约0.05％至约0.1％重量/体积的量存在，并且其中所述阳离子脂质相对于每微克核酸以约1微升至约3微升的量存在。

8、在一些实施方式中，所述核酸包含非编码rna或编码rna，其中所述rna以所述制剂的约0.0015至约0.0035％重量/体积的量存在，其中所述酪蛋白亚单元的混合物以所述制剂的约2.2％至2.8％重量/体积的量存在，其中所述壳聚糖以所述制剂的约0.06％至0.09％重量/体积的量存在，并且其中所述阳离子脂质相对于每微克核酸以约1微升至约2微升的量存在。

9、在一些实施方式中，对受试者给药后，所述rna减少il1-b、il-6、tgfβ、nlrp3、p21和il-4中的一种或多种的表达。在一些实施方式中，对受试者给药后，所述rna降低受试者的收缩压。在一些实施方式中，对受试者给药后，所述rna降低受试者的舒张压。在一些实施方式中，对受试者给药后，所述rna增强受试者的至少一个肌肉的肌肉耐力、肌肉抗疲劳性、肌肉力量和/或肌肉收缩性。根据实施方式，肌肉可以是骨骼肌或心肌。在一些实施方式中，对受试者给药后，所述rna降低脑钠肽的表达。

10、在一些实施方式中，对受试者给药后，所述rna降低舒张期二尖瓣口流入速度与二尖瓣环组织速度比率(e/e’)。在一些实施方式中，对受试者给药后，所述rna增强受试者的葡萄糖耐受性。在一些实施方式中，对受试者给药后，所述rna减少受试者每单位体重的肥胖和/或皮下脂肪组织。在一些实施方式中，对患有心肌梗塞的受试者给药后，所述rna减小心肌梗塞后的梗塞面积。在一些实施方式中，在对患有心肌梗塞的受试者给药后，所述rna降低心肌梗塞后的循环心肌肌钙蛋白i浓度。

11、在一些实施方式中，所述制剂减轻与炎症和/或纤维化增加相关的疾病的一种或多种症状。在一些实施方式中，所述疾病选自射血分数保留型心力衰竭、心肌梗塞、肌营养不良、硬皮病、病毒感染和肥厚性心肌病。在一些实施方式中，所述制剂包含与seq id no:1-25、31、32中的一个或多个具有至少90％序列同一性的核酸。在一些实施方式中，所述制剂包含基本上由与seq id no:1-25、31、32中的一个或多个具有至少90％序列同一性的序列组成的核酸。在一些实施方式中，所述制剂包含与seq id no.26-30中的一个或多个具有至少80％序列同一性的一种或多种酪蛋白。

12、还提供了一种用于治疗与炎症和/或纤维化相关的疾病的方法，包含给予患有表现出炎症和/或纤维化的疾病的受试者治疗有效量的本发明公开的制剂。另外提供了本发明公开的制剂用于治疗与炎症和/或纤维化相关的疾病的用途。另外提供了本发明公开的制剂用于制备用于治疗与炎症和/或纤维化相关的疾病的药物的用途。在一些实施方式中，所述疾病包含射血分数保留型心力衰竭、心肌梗塞、肌营养不良、硬皮病、病毒感染和/或肥厚性心肌病。

13、在一些实施方式中，提供了一种制造用于口服递送核酸的制剂的方法，所述方法包含通过使核酸与包含阳离子脂质的溶液接触来将核酸包封在人工脂质胶束中，从而产生包含核酸的人工脂质胶束，通过使所述包含核酸的人工脂质胶束与包含2％至10％酪蛋白的溶液接触来使酪蛋白涂覆包含核酸的人工脂质胶束，从而产生包含核酸的酪蛋白涂覆的人工脂质胶束，并且将所述包含核酸的酪蛋白涂覆的人工脂质胶束暴露于酸和壳聚糖聚合物的混合物，其中所述酸和壳聚糖聚合物的混合物允许所述壳聚糖连同酪蛋白的嵌入以及包含核酸的酪蛋白-壳聚糖涂覆的脂质胶束的沉淀。

14、在一些实施方式中，使所述核酸以每微克核酸约0.5μl至2.0μl脂质溶液的比例与阳离子脂质接触。在一些实施方式中，所述方法还包含将液体介质添加到所述核酸和阳离子脂质溶液中以达到约100μl的最终体积。在一些实施方式中，所述酪蛋白包含于5％牛酪蛋白溶液的溶液内，并且以1:10的体积比添加到所述包含核酸的人工脂质胶束中。在一些实施方式中，所述酸和壳聚糖聚合物的混合物包含约0.05％至2％的乙酸溶液和约0.1％至2％的壳聚糖溶液。

15、在一些实施方式中，提供了一种用于治疗与炎症和/或纤维化相关的疾病的方法，包含向受试者给予口服制剂，所述口服制剂包含核酸、阳离子脂质、至少一种酪蛋白、和壳聚糖。在一些实施方式中，每天给予所述口服制剂。在一些实施方式中，单次口服给药有效地改善或治疗与炎症和/或纤维化相关的疾病。在一些实施方式中，所述核酸包含核糖核酸(rna)，并且其中rna以所述制剂的约0.00001％至0.01％重量/体积的量存在，其中至少一种酪蛋白包含至少一种α-s1酪蛋白亚单元，并且以所述制剂的约0.5％至5％重量/体积的量存在；并且其中壳聚糖以所述制剂的约0.001％至1％重量/体积的量存在。

16、提供了一种分离的核酸，所述核酸包含cguccgaugguaguggguuaucag(seq id no:12)的核苷酸序列，其中所述核酸是rna，其中所述核酸的长度至多为30nt。还提供了一种分离的核酸，所述核酸包含与cguccgaugguaguggguuaucag(seq id no:12)至少95％相同的核苷酸序列，其中所述核酸是rna，其中所述核酸的长度至多为30nt。任选地，所述核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸包含1-10个化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸包含核苷酸序列1-12位上的至少一个化学修饰的核苷酸和/或13-24位上的至少一个化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述化学修饰的核苷酸包含主链修饰。在一些实施方式中，所述主链修饰包含主链糖修饰。在一些实施方式中，所述核酸包含核苷酸序列的1、3、5、20、22和24位上的一个或多个化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述化学修饰的核苷酸是锁核酸(lna)。在一些实施方式中，所述核苷酸序列包含核苷酸序列的1、3、5、20、22和24位上的lna。在一些实施方式中，所述核酸的长度为24个核苷酸。

17、提供了一种分离的核酸，所述核酸包含与cguccgaugguaguggguuaucag(seq idno:12)至少95％相同的核苷酸序列，其中所述核酸是rna。任选地，所述核苷酸序列为cguccgaugguaguggguuaucag(seq id no:12)。在一些实施方式中，所述核酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸包含1-10个化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸包含核苷酸序列1-12位上的至少一个化学修饰的核苷酸和/或13-24位上的至少一个化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述化学修饰的核苷酸包含主链修饰。在一些实施方式中，所述主链修饰是主链糖修饰。在一些实施方式中，所述核酸还包含在核苷酸序列的1、3、5、20、22和24位上的一个或多个化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述化学修饰的核苷酸是锁核酸(lna)。在一些实施方式中，所述核苷酸序列包含核苷酸序列的1、3、5、20、22和24位上的lna。在一些实施方式中，所述核酸的长度至多为30nt。

18、在一些实施方式中，核酸由以下核苷酸序列组成或基本上由以下核苷酸序列组成：cguccgaugguaguggguuaucag。

19、一种由以下核苷酸序列组成的核酸：cguccgaugguaguggguuaucag(seq id no:2)，其中所述核酸是rna，其中所述核苷酸序列的1、3、5、20、22和24位上的每个是lna。

20、还提供了一种组合物，所述组合物包含：本发明的任意一种分离的核酸；和药学上可接受的赋形剂。任选地，所述组合物还包含转染试剂。任选地，所述转染试剂包含脂质体、细胞外囊泡(ev)和聚乙二醇(peg)-阳离子脂质复合物(pclc)中的一种或多种。在一些实施方式中，所述转染试剂包含来源于心肌球衍生细胞(cdc)的ev。在一些实施方式中，所述组合物还包含酪蛋白磷酸蛋白。任选地，所述组合物还包含壳聚糖。任选地，所述分离的核酸包封在酪蛋白-壳聚糖复合物中。在一些实施方式中，所述组合物包含酪蛋白胶束。

21、提供了一种暴露于或转染有本发明的任意一种核酸的巨噬细胞，其中与不含所述核酸的巨噬细胞相比，所述巨噬细胞的抗炎活性增加。任选地，所述巨噬细胞在受试者体内。任选地，所述巨噬细胞在培养物中。

22、还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：本发明的任意一种核酸；和转染试剂。任选地，转染试剂是脂质体、细胞外囊泡(ev)和聚乙二醇(peg)-阳离子脂质复合物(pclc)中的一种或多种。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含酪蛋白磷酸蛋白。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含壳聚糖。

23、还提供了一种用于治疗心脏病症或其症状的方法，所述方法包含向需要治疗心脏病症或其症状的受试者给予治疗有效量的本发明所述核酸中的任一种或本发明所述组合物中的任一种，从而治疗心脏病症或其症状。任选地，所述心脏病症包含心力衰竭的症状和/或后遗症。在一些实施方式中，所述心脏病症包含肥厚性心肌病。在一些实施方式中，所述心脏病症包含射血分数保留型心力衰竭(hfpef)。在一些实施方式中，所述心脏病症包含感染性疾病的症状或后遗症。在一些实施方式中，所述感染性疾病包含病毒感染。在一些实施方式中，所述受试者患有心脏病症。在一些实施方式中，所述受试者有发展心脏病症的风险。在一些实施方式中，所述受试者在给药之前表现出以下中的一种或多种：高血压、通过超声心动描记术检测的升高的e/e’比率、心脏肥大、心肌纤维化、肥胖、消瘦、耐力下降和系统性炎症标志物升高。

24、还提供了一种用于治疗肌肉紊乱或其症状的方法，所述方法包含向需要治疗肌肉紊乱或其症状的受试者给予治疗有效量的本发明所述核酸中的任一种或本发明所述组合物中的任一种，从而治疗肌肉紊乱或其症状。任选地，所述肌肉紊乱包含肌营养不良或心脏病症。在一些实施方式中，所述肌肉紊乱包含裘馨氏肌肉萎缩症。在一些实施方式中，所述受试者患有肌肉紊乱。在一些实施方式中，所述受试者有发展肌肉紊乱的风险。在一些实施方式中，所述受试者在遗传上倾向于发展肌肉紊乱。在一些实施方式中，所述受试者在给药之前表现出以下中的一种或多种：耐力下降和骨骼肌功能下降。

25、还提供了一种用于治疗炎症病症的方法，所述方法包含向需要治疗炎症病症的受试者给予治疗有效量的本发明所述核酸中的任一种或本发明所述组合物中的任一种，从而治疗炎症病症。任选地，所述炎症病症包含感染性疾病的症状或后遗症。在一些实施方式中，所述感染性疾病包含病毒感染。在一些实施方式中，所述炎症病症包含细胞因子风暴。在一些实施方式中，所述炎症病症与免疫治疗(例如，针对癌症)相关。在一些实施方式中，所述炎症病症是硬皮病，所述硬皮病是影响皮肤的自身免疫病症。在一些实施方式中，所述炎症病症是系统性硬化，所述系统性硬化是类似硬皮病但不仅影响皮肤而且影响包含肺和心脏在内的内部器官的自身免疫病症。

26、还提供了一种用于治疗纤维化病症的方法，所述方法包含向需要治疗纤维化病症的受试者给予治疗有效量的本发明所述核酸中的任一种或本发明所述组合物中的任一种，从而治疗纤维化病症。任选地，所述纤维化病症包含感染性疾病的症状或后遗症。在一些实施方式中，所述感染性疾病包含病毒感染。在一些实施方式中，纤维化病症是特发性肺纤维化。在一些实施方式中，纤维化病症是肝硬化。

27、在一些实施方式中，所述治疗有效量的核酸包含约0.001μg/g至约100μg/g。在一些实施方式中，本发明所述任意一种用于治疗的方法包含给予治疗有效量的核酸或组合物不超过一周两次。在一些实施方式中，所述方法包含静脉内、肌内、心内或口服给予治疗有效量的核酸或组合物。任选地，口服给予治疗有效量的核酸或组合物。

28、还提供了一种提升巨噬细胞的抗炎活性的方法，所述方法包含将本发明所述核酸中的任一种或本发明所述组合物中的任一种与巨噬细胞群体接触，从而提升所述群体的巨噬细胞的抗炎活性。任选地，所述接触包含向需要治疗特征为炎症或纤维化的病症的受试者给予有效量的核酸或组合物，从而提升受试者中巨噬细胞的抗炎活性。在一些实施方式中，所述巨噬细胞是人巨噬细胞。