本发明涉及一种通过用固定化细胞对含有含糖碳基底物的培养基进行连续发酵来生产醇的方法。
背景技术：
0、现有技术
1、为了应对能源转型的挑战，正在进行大量研究以开发“绿色”方法，允许以替代石油炼制和/或石油化学的方式获取化学中间体。
2、衍生自发酵方法的醇(例如异丙醇和正丁醇)是石油化学衍生物最有前景的替代品之一。由属于梭菌属的微生物进行的abe(丙酮-丁醇-乙醇)发酵是最古老的已经工业化的发酵之一，并自此得到了广泛的研究。最近，产生异丙醇、丁醇和乙醇的混合物并且也由特别属于梭菌属的产溶剂微生物进行的ibe(异丙醇-丁醇-乙醇)发酵已成为众多研究的主题。
3、关于此类方法中采用的发酵方法，批量生产仍然是abe和ibe发酵的常规方法，尽管此类方法表现出低产率，在0.1-0.7g/l.h范围内(参见例如，jones d.t.,woods d.r.,1986,acetone-butanol fermentation revisited.microbiol.rew.,50(4),484-524或表16.6lopez-contreras a.等人第16章,bioalcohol production:biochemical conversionof lignocellulosic biomass,2010)。然而，这些产率仍然太低，以致无法设想经济上可行的工业方法。
4、还可以设想其中细胞悬浮在均质反应器中的连续方法。然而，产率也相对低，并且不容易显著提高。一个技术问题是发酵培养基中细胞的浓度，其主要由该方法中应用的稀释率控制。该比率不能高，以避免细胞被“冲洗出”生物反应器。
5、由于这些原因，近年来人们对针对微生物生物质的高保留的方法表现出极大的兴趣，特别是通过将微生物固定在生物反应器中。由于微生物在这些条件下的停留时间与所研究的生物反应器的流体动力学停留时间不相关，因此使用具有固定化细胞的连续方法能够显著提高醇的体积产率。而且，生物反应器中微生物的浓度更高。
6、因此，本发明将更具体地关注固定细胞的技术：因此，专利fr-3086670中提出了一种方法，其中至少一部分细菌生物质(biomass)通过以生物膜形式吸附在基于聚氨酯泡沫型聚合物泡沫的多孔材料上而固定在发酵反应器中。这种材料已被证明是特别有效的，允许连续发酵过程，泡沫使得可以以足够大量的方式固定细菌，即超过导致细胞被冲洗出的稀释率。该材料开辟了生产ibea型混合物的新途径，同时还提供通过固定细菌生物质以连续模式进行生产。
7、对于发酵过程的性能，评估固定在发酵反应器中的载体上的微生物的功效是有用的。这是因为微生物以生物膜的形式固定在固体载体上。该生物膜由微生物细胞和细胞外聚合物的混合物组成。生物膜形成的过程不容易可控，并且取决于许多因素。具体地，生物反应器中的流体动力学条件、所用载体的物理化学性质及其数量特别可以影响生物膜发展。该结构内的存活细胞以及由此产生代谢物的细胞的比例也可以根据所研究的生物膜的年龄以及方法的操作条件而有很大变化。此外，固定化微生物倾向于产生丁醇，丁醇是一种抑制微生物生长的化合物，这导致必须增加含有待发酵糖的流体的流入体积流量(以及含有发酵产物的流体的流出流量)。
8、由于所有这些原因，已经发现监测沉积在生物反应器中的载体上的生物膜中活微生物的总量是优化管理发酵过程的关键参数。然而，难以对此进行监测。具体地，难以设想在生物反应器外部对载体进行采样，因为生物反应器通常在无菌和低氧的极端条件下操作，而定期打开生物反应器来采集这些样品会显著干扰这些条件。此外，获得可以量化存活细胞总浓度的代表性样品是复杂的。最后，提取方法需要时间，并且可能会给测量带来显著偏差。
9、此外，研究集中在估计生物膜的生长速率的方法上，尤其是通过电化学途径，如专利申请ep-3035052中特别描述的，然而没有成功地估计这些生物膜中活微生物的比例。此外，这些解决方案在工业规模装置中的实施是复杂的。
10、因此，本发明的目的是克服这些缺陷。本发明的目的特别是开发利用固定在载体上的微生物的发酵方法，其更容易控制。本发明的目的特别是更容易和/或更精确地量化这些固定化微生物的活性变化。
技术实现思路
0、发明概述
1、本发明的主题首先是一种生产(一种或多种)醇的方法，根据所述方法，将含有含糖碳基底物的培养基引入到包括其上固定有微生物的载体的反应段中，以通过在所述微生物作用下的发酵来生产富含(一种或多种)醇的醪料(must)和一种或多种发酵气体(co2/h2)，使得所述方法在液相中连续操作，并且使得为了控制生产，在不干预所述载体的情况下监测固定在载体上的活微生物的数量。
2、术语“反应段”应理解为至少一个生物反应器以及使其可以进行发酵的所有设备。如果反应段包括多个生物反应器，则这些生物反应器可以并联和/或串联操作。其中一些可以正在运行，而其它一个或多个正在进行维护，特别是更换固定载体，以免中断生产。
3、术语“载体”应理解为是指一种材料，例如上述专利fr-3086670中描述的类型，微生物可以沉积在其壁上(并逐渐形成生物膜)，然后参考固定化微生物。它通常是多孔材料，其可以是聚合物性质的，例如基于聚氨酯的泡沫类型的泡沫，或者是矿物性质的，例如陶瓷类型的多孔材料等。它可以是单体(monobloc)形式，或者是在进行发酵的反应段的体积中以有序方式(例如以叠置层)或无序方式(松散)布置的多个块的形式。这些块可以具有规则的几何形状并且具有相同的尺寸(例如立方体)，或者具有不规则的形状和/或具有不同的尺寸。
4、表述“不干预所述载体”被理解为是指本发明不涉及对载体的任何操作，特别是其避免在反应段外部采集载体的样品，特别是考虑到对它们进行分析。这意味着本发明是在不打开反应段、不打开包括反应段的(一个或多个)生物反应器的情况下实施的，因为已知在发酵领域中反应段((一个或多个)生物反应器)通过关闭、密封、在不进入外部大气的情况下来实施。
5、术语“微生物”应理解为能够通过发酵将分子转化成其它感兴趣分子的生物体。在下面的描述中，这些也可以表示为“细胞”或“细菌”。
6、术语“活的”在本文中与涉及微生物的“存活的”具有相同的含义：它涉及被认为对发酵具有活性的微生物。
7、术语“悬浮”与术语“游离”具有相同的含义，并且表示悬浮在液相中的细胞，与固定在底物上的细胞相对。
8、因此，根据本发明做出选择以根据载体上的活微生物来控制(一种或多种)醇的生产，这是实现这一点的最可靠的方式，最尤其是在生产启动时。具体地，当启动生产时，第一步包括在生物反应器中布置载体，其为例如多孔样聚合物泡沫，然后通过将含有微生物的流体注入生物反应器中来沉积微生物，并且被称为预培养。这些微生物通过形成生物膜(其为微生物和细胞外聚合物的混合物)而逐渐部分地在载体上定殖。另一部分微生物将保留在生物反应器中的液相中。生物膜的生长难以控制，并且它们所含活微生物的部分甚至更是如此。
9、悬浮和固定的微生物在糖转化为醇方面都具有活性；然而，悬浮的微生物易于被冲洗出(也就是说，在从生物反应器中提取醇的过程中与醇一起被取出)。此外，已经发现，本身活的固定化微生物也会产生丁醇，丁醇是一种抑制微生物生长的化合物。
10、具体而言，随着生物膜的生长，考虑到固定化活微生物数量的增加，必须改变方法参数，并且通常将增加反应物进入反应器的流入流量(含有待转化糖的流体的流入流量)和出反应器的反应产物的流出流量(含有通过糖的发酵获得的醇的流体的流出流量)。因此做出选择，以用于控制该方法，并因此，特别是改变这些流入/流出流量，以评估固定化活微生物的数量。但本发明的核心在于，这种监测可以在不干预载体的情况下进行，也就是说，具体而言，无需打开生物反应器以进行操作或处理，特别是无需对载体的部分进行采样。现在，在不打开生物反应器或不中断其操作的情况下进行这种评估是极其有利的。这是因为这些生物反应器通常在无菌和低氧条件下操作：反应器的任何打开，特别是载体的任何采样，对于成功维持这些无菌和低氧条件来说都是非常复杂的，或者甚至不可能实现，最尤其是在工业规模上。
11、为此，根据本发明，基于对反应段的液相和所产生的(一种或多种)发酵气体进行的分析来监测固定在载体上的活微生物的数量。
12、因此，本发明已开发了通过耦合以下来间接监测固定化活微生物的数量：
13、-对液相的测量(其可容易地从生物反应器中采样，或甚至是在线的)，这将使得可以确定反应器中悬浮活微生物的数量，
14、-以及对发酵气体的测量(其也可容易地从反应器中采样)，这将使得可以估计活微生物的总量，即悬浮和固定的活(活性)微生物的总和。通过这种数据耦合，然后可以由此推断出固定化活微生物的数量的估计值，并且这是在不接触载体、不打开生物反应器、并且不改变/中断生物反应器的操作的情况下完成的。通过该估计值，本发明使得可以非常精确地调节(增加)流入/流出流量，以便尽可能准确地考虑和抵消抑制性丁醇的形成。该估计值还能使得可以根据抑制性化合物的形成以外的标准控制生产：例如，它能使得可以评估载体所含微生物的饱和度。这是因为，超过一定时间段后，载体很大程度上被微生物定殖，并且出现堵塞现象：当载体材料为块或颗粒形式时，可以在颗粒/块之间和/或当其材料是多孔的时在颗粒/块内观察到堵塞，这然后导致产量下降。此外，有必要考虑生物膜中细胞的死亡率，因此观察到的饱和度是随着时间的推移增加的堵塞现象和增加的细菌死亡的组合。因此，本发明使得可以评估活微生物的逐渐减少，并因此评估死微生物数量的增加，并因此帮助决定更换一些或全部载体。
15、优选地，对反应段的液相的分析包括测量反应段的液相中悬浮微生物的存活率。
16、有利地，通过流式细胞术对所述液相的样品测量反应段的液相中悬浮的微生物的存活率。
17、流式细胞术(fc)是一种可以对细胞进行单独分析的技术。细胞在通过激光束前方之前根据流体动力学聚焦原理对齐。产生的光学现象允许分析细胞的物理特征(尺寸、结构)或用常用试剂培育后的生物特征。
18、这种分析技术在本发明的背景下非常令人感兴趣，因为首先，它能够以活微生物数量的测量为目标，其次因为它使得可以快速获得结果，特别是在少于1小时内(例如15或30分钟)。
19、优选地，分析的样品取自反应段或取自离开反应段的发酵醪料料流，优选根据固定或变化的频率采集样品。因此可以在生产启动时选择较高的频率，然后选择较低的频率。采样和相关测量的频率可以例如是大约十分钟、一小时或一天的量级，这取决于生产运行的进度。还可以对离开反应段的发酵醪料料流连续地、在线进行分析，并且可以自动化。
20、对所产生的(一种或多种)发酵气体的分析优选包括在反应段的出口处对其流量进行测量。这是因为，在生物反应器中，通常在气体顶部空间水平处的上部提供有配备有阀的出口，该阀使得可以容易地回收样品或测量气体的流出流量，已知发酵产生气体，通常是氢气和二氧化碳的混合物h2/co2。评估产生的发酵气体的量可以估计生物反应器中活微生物的总量(悬浮的和固定的)。
21、根据本发明，因此对反应段的液相进行分析以确定所述液相的存活微生物的浓度，对产生的(一种或多种)发酵气体进行分析(特别是流量分析)以评估反应段的存活微生物的总浓度，并从这些分析中推导出固定在载体上的存活微生物浓度的评估。浓度被理解为生物反应器中每毫升反应体积的细胞/微生物的数量。
22、因此，根据本发明，将可以根据对固定在载体上的活微生物的数量的监测来调节流入反应段的含糖料流的流入流量和/或出反应段的醪料的流出流量，这实际上相当于调节生物反应器中发酵的稀释率。
23、如上所述，微生物在载体上形成逐渐生长的生物膜，并且所述生物膜在载体上的生长可以根据对固定在载体上活微生物的数量的监测来评估，这可以产生生产启动时的相关信息(用于监测微生物在载体上的初始附着)，以及进一步关于生产运行中的相关信息：特别是可以根据对所述生物膜生长的监测来至少部分地评估载体的饱和度(saturationlevel)。
24、有利地，根据本发明，产生包含异丙醇、丁醇和乙醇的发酵醪料，所述微生物源自属于梭菌属的菌株。
25、本发明的主题还是一种用于从含有含糖碳基底物的流体生产(一种或多种)醇的系统，以便通过微生物作用下的发酵产生富含(一种或多种)醇的醪料和一种或多种发酵气体，从而实现上述方法。
26、本发明的主题还是一种用于从含糖流体生产(一种或多种)醇的系统，以便通过微生物作用下的发酵生产富含(一种或多种)醇的醪料和一种或多种发酵气体，使得所述系统包括：
27、-反应段，其包括载体，特别是聚氨酯型聚合物泡沫形式的载体，微生物固定在载体上，所述反应段提供有用于含糖流体的入口和用于醪料的出口，
28、-用于监测固定在载体上的活微生物的数量而不干预所述载体的装置。
29、优选地，所述监测装置包括：
30、-流式细胞术装置，其基于从反应段采集的样品来测量反应段的液相中悬浮的微生物的存活率，
31、-用于在反应段出口处测量产生的(一种或多种)发酵气体的流量的装置，
32、-计算装置(任何电子/计算机装置)，其根据细胞术测量值和气体流量测量值推导固定在载体上的活微生物的数量。
33、根据本发明的反应段优选包括在无菌和低氧条件下操作的一个或多个生物反应器。
34、下面将更详细地描述本发明，并且将借助(一个或多个)实施例和附图来说明本发明，但其并不限制所述发明。
35、附图列表
36、图1高度示意性地呈现实施本发明的生物反应器。
37、图2高度示意性地呈现根据本发明的方法的框图。
38、图3是呈现(发酵)气体流量随活微生物(“活性”细胞)浓度变化的曲线图。
39、图4是呈现活微生物(“活性”细胞)浓度随时间变化的曲线图。
40、图5是呈现活微生物(“活性”细胞)的估计浓度随实验测量的相同浓度变化的曲线图。
41、图6是呈现如根据本发明的方法所推导的固定在载体上的活微生物的浓度随时间变化的曲线图。
42、实施方案的描述
43、本发明更特别地对具有固定化细胞的ibe型或abe型发酵感兴趣，其实例描述于上述专利fr-3086670中，可对该专利做出引用。
44、采用具有固定化细胞的连续ibe或abe发酵方法，以便从可再生资源中生产异丙醇和丁醇。这些方法中使用的细菌特别能够降解某些单糖，以形成丁醇、异丙醇以及h2/co2混合物形式的气体。
45、丁醇的毒性和产溶剂相(solventogenic phase)中细菌的低生长速率限制了批量和简单连续方法的性能。使用具有固定化细胞的连续方法能够显著提高体积产率，因为细菌在这些条件下的停留时间与所研究的生物反应器的流体动力学停留时间不相关。此外，生物反应器中细菌的浓度增加。
46、细菌以生物膜的形式固定在固体载体上。该生物膜包含细胞和细胞外聚合物的混合物。生物膜形成的过程难以控制，并且取决于许多因素。具体地，生物反应器中的流体动力学条件、所用载体的物理化学性质及其数量都可以影响生物膜发展。该结构内的存活细胞以及由此产生代谢物的细胞的比例也可以根据所研究的生物膜的年龄以及该方法的操作条件而有很大变化。
47、应当注意的是，活性生物质同时悬浮在液体培养基中和位于固体载体上。因此，对生物反应器内生物膜的活性细胞的总数量的监测是已知为了优化控制该过程的关键参数。这是因为存活的固定化细胞会产生丁醇，这是一种抑制细菌生长的化合物。因此，随着生物膜在载体(在以下实例中基于聚氨酯泡沫)内的生长需要增加该方法的流入和流出体积流量。
48、然而，在具有固定化细胞的发酵方法过程中不能进行固体载体的采样。这是因为载体的采样可能会导致在方法的无菌和低氧条件的维持方面的问题。因此，用于间接监测生物膜的发展/这些生物膜中固定化活性细胞的数量的方法是完全令人感兴趣的。
49、因此，下文描述的本发明的实施方式是一种与通过流式细胞术测量悬浮活性细胞的浓度耦合的在线测量气体流量的方法，以便估计固定在固体载体(生物膜)上的活性细胞的数量。
50、具体地，在反应器出口处测量的气体流量与通过流式细胞术测量的活性细胞的总浓度相关(参见下面的等式)。因此，当通过该相同的方法测量液体培养基中活性细胞的浓度时，可以估计固定化活性细胞的比例。因此，本发明使得可以在尽管不对固体载体进行采样的情况下估计发酵启动期间生物膜的发展，这代表该方法的启动管理的优点。
51、
52、本发明可以在具有固定化细胞的连续ibe或abe发酵过程中实施。在这种类型的发酵过程中，细胞被吸附到多孔载体上，优选聚氨酯泡沫。随着发酵的继续，细胞在该多孔载体内繁殖。
53、图1是能够实施本发明的生物反应器1的高度简化呈现。它没有详细说明生物反应器的所有常规设备，并且不一定按比例绘制。生物反应器1界定基本竖直圆柱体形式的内部体积，其被分成填充有液相的下部体积v1和作为反应器的气体顶部空间的上部体积v2。生物反应器1包括进料有含有含糖碳基底物的流体料流的入口2和出口3，富含醇的发酵醪料3从出口3取出。体积v1提供有(一个或多个)聚氨酯泡沫载体4。生物反应器1提供有用于搅拌液相的装置5、允许采集液相样品以对其进行流式细胞术分析的出口5以及体积v2中允许采集气相样品或测量气相的流出流量的出口6。
54、本发明的方法可以以图2所示的框图的形式来概括。
55、-步骤a：测量离开气体顶部空间v2(出口6，提供有阀并配备有常规流量测量装置)的(发酵)气体的流量，在以下实例中使用气体流量计或体积式流量计，得到h2/co2混合物的气体体积流量值。测量的流量可在0至5l.l反应器-1.h-1之间变化，但优选在0.5至3l.l反应器-1.h-1之间变化，
56、-步骤b：由此推导出总活性细胞(悬浮在液相中和固定在体积v1中的载体4上的)的估计值，如下文详述，
57、-步骤c：通过采集液相样品(出口5)来分析悬浮在液相v1中的细胞的存活率，该分析通过流式细胞术进行。该分析可以是自动化的。以下实例中采用的方法如下：通过将从生物反应器采样的细胞悬浮液在mcilvaine缓冲液中稀释直至获得5×105至2×106cells.ml-1(细胞/ml)之间的浓度来测量存活率。一旦达到该浓度，将碘化丙啶和羧基荧光素二乙酸酯添加到细胞悬浮液中至10μg.ml-1的最终浓度。然后借助配备有氩激光器(λ：488nm)的流式细胞术分析细胞悬浮液。收集在激光各角度下和激光轴内散射的光并针对每个检测到的颗粒进行分析。垂直于激光轴散射的光通过带通滤波器(530±15nm)以收集绿色荧光，并且还通过高通滤波器(>630nm)以收集红色荧光。相较于干质量浓度的测量，流式细胞术可以测量总生物质中的活性细胞，从而可以更精确地计算该方法的比产率，
58、-步骤d：由此推导出悬浮在液相中的活性细胞的数量，
59、-步骤e：根据步骤c和d的结果，推导出固定在载体4上的活性细胞的浓度的估计值，
60、-步骤f：利用步骤e的结果来执行发酵方法(特别是选择流入2流量和流出3流量)。
61、该方法以给定频率重复，该给定频率可在发酵方法的过程中变化。
62、可使用的含糖碳基料流的类型、微生物的类型和载体的类型在下文中描述。
63、含有含糖碳基底物2的流体。
64、根据一个或多个实施方案，含有含糖碳基底物的流体包括从木质纤维素获得的c5和/或c6糖的水溶液，和/或从产糖植物获得的糖(例如，葡萄糖、果糖和蔗糖)的水溶液和/或从淀粉植物中获得的糖(例如，糊精、麦芽糖和其它低聚物，或甚至淀粉)的水溶液。根据一个或多个实施方案，c5和/或c6糖的水溶液源自可再生资源的处理。根据一个或多个实施方案，可再生资源是木质纤维素生物质类型，其可尤其包括木质基质(例如，落叶植物和针叶植物)、农业副产品(例如，秸秆)或来自产生木质纤维素废物的工业的副产品(源自农业食品或造纸工业)。可再生资源还可源自产糖植物，例如糖甜菜和甘蔗，或源自淀粉植物，例如玉米和小麦。c5和/或c6糖的水溶液也可以源自各种可再生资源的混合物。根据一种执行模式，该溶液在120℃下灭菌20分钟。
65、通过属于梭菌属的菌株产生的生物质。
66、细菌生物质主要以生物膜的形式吸附到固体载体上。优选地，细菌是属于拜氏梭菌(clostridium beijerinckii)种和/或丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)种的菌株。在该方法中使用的细菌可以是或可以不是经基因修饰的并且自然产生异丙醇的菌株和/或天然产生丙酮并且经基因修饰以使其产生异丙醇的梭菌菌株。在以下实例中，它是拜氏梭菌dsm 6423。
67、固体载体
68、固体载体包括聚氨酯泡沫。聚氨酯泡沫是特别有利的，因为它不仅允许生产ibea型的混合物，而且还允许通过固定细菌生物质进行连续型生产。具体地，聚氨酯泡沫能够以足够大量的方式(即超过导致细胞被冲洗出的稀释率)固定梭菌属细菌，使得可以连续生产ibea型混合物。此外，聚氨酯泡沫适合于通过浸没固定在反应器中。或者，可以使用基于(一种或多种)陶瓷材料的泡沫。
69、根据一个或多个实施方案，聚氨酯泡沫具有：
70、-体积空腔(即孔隙或泡孔)，其等效球体直径为0.1mm至5mm，优选0.25mm至1.1mm，优选0.55mm至0.99mm，和/或
71、-表观密度(即每单位体积的表观质量)，其在空气中测得为10至90g/l，优选10至80g/l，优选15至45g/l，例如20至45g/l或25至45g/l。
72、在用拜氏梭菌dsm6423进行分批发酵的情况下，首先建立悬浮的活性细胞与发酵气体流量之间的相关性，并呈现在图3中，图3是呈现x轴上以cells.ml-1为单位的活性细胞浓度和y轴上以l.h-1为单位的离开生物反应器的气体流量的曲线图。
73、这些测试在gapes培养基上在34℃下且无ph调节的情况下进行。
74、这些测试的操作条件如下：
75、calam培养基还原之后，其组成在下表1中给出，通过在100℃下热休克1分钟来活化孢子，并将培养基接种至2％。然后在厌氧条件下并以100rpm搅拌来在34℃下培育预培养物24小时。
76、表1
77、 组成 浓度(g.l-1) 马铃薯 250 <![cdata[(nh<sub>4</sub>)<sub>2</sub>so<sub>4</sub>]]> 2.0 <![cdata[caco<sub>3</sub>]]> 2.0 葡萄糖 10.0
78、然后在发酵罐的最终接种之前，在gapes培养基中进行第二次预培养，其组成在下表2中给出。这次，将gapes培养基接种至10％，然后在厌氧条件下并以100rpm搅拌在34℃下培育预培养物24小时。
79、表2
80、
81、
82、最后，在反应器中使用已预先还原且接种至10％的gapes培养基进行发酵。采用的培养条件为：温度为34℃，搅拌速度为200rpm，无氮气鼓泡且无ph调节。
83、在连续发酵的情况下，第一批生长期发生8小时，然后将反应器连接至进料瓶(gapes培养基)和取出瓶。进料开始并逐渐增加。
84、借助ritter体积式流量计测量气体流量，并通过用cfda标记和流式细胞术分析来测量活性细胞的数量。
85、测量方案如下：
86、mcilvaine缓冲液ph4
87、1.制备0.1m(即19.21g/l)柠檬酸溶液和0.2m(即28.38g/l)na2hpo4溶液。
88、2.为了得到等于4的ph，将307.25ml的0.1m柠檬酸溶液与192.75ml的0.2m na2hpo4溶液混合。验证所得缓冲溶液的ph。
89、3.过滤溶液并将其在4℃下储存。
90、存活率标记物
91、碘化丙啶：在milliq水中1.4986mm–储存于4℃。
92、biomérieux销售的chemchrome v8(cfda：羧基荧光素二乙酸酯)：在丙酮中0.217μm–储存于-20℃。
93、细胞标记
94、1.在mcilvaine缓冲液中稀释细胞悬浮液，以得到约1×106细胞/ml的浓度。
95、2.将10μl的chemchrome v8和10μl的碘化丙啶添加到1ml的稀释细胞悬浮液中。
96、3.在40℃下培育10分钟。
97、4.通过流式细胞术运行样品。
98、图3是呈现所测量的(发酵)气体流量(以l.h-1为单位表示)随活微生物(以“活性”细胞计)的浓度(以每毫升生物反应器体积v1(工作体积)的存活细胞数表示)变化的曲线图。该图展示得到了气体流量与通过流式细胞术测量的活性细胞浓度之间的线性关系。因此，后者使得可以根据以下关系估计发酵气体的比细胞产率：
99、
100、参数qg的值实际上对应于回归线的斜率：5.54×10-10±3.5×10-11l.cells-1.h-1。假设比细胞产率qg随时间恒定，则可以使用该同一关系来根据连续发酵期间测量的气体流量计算活性细胞的总量。因此，在第二阶段中使用该方法来估计用游离细胞进行连续发酵过程中活性细胞的浓度。
101、结果图示于图4和图5中：
102、-图4是呈现x轴上以小时表示的时间和y轴上以活性细胞/ml表示的在34℃下用游离细胞进行ibe发酵过程中的活性细胞浓度的曲线图。
103、-图5是呈现x轴上以活性细胞/ml表示的在34℃下用游离细胞进行ibe发酵过程中的估计活性细胞浓度和y轴上以相同单位表示的实验测量的活性细胞的曲线图。
104、游离细胞浓度的估计结果呈现在图4中。连续图表示基于测量的气体流量对活性细胞浓度随时间变化的估计。
105、图5中的白点代表通过流式细胞术测量的活性细胞浓度：图5显示基于分批发酵过程中实验计算的比细胞产率qg估计的数据与实验数据接近(r2＝0.87)。该测试使得可以验证比细胞产率qg(5.54×10-10l.cells-1.h-1)恒定的假设。
106、因此，相当可以估计发酵过程中总活性细胞的浓度。然后可以创造性地使用这种关系，以估计用固定化细胞进行连续过程的生物膜中活性细胞的浓度，条件是固定化细胞的气体比细胞产率等于悬浮液中测量的比细胞产率。
107、
108、因此
109、
110、在这种情况下，通过流式细胞术进行悬浮液中的活性细胞数量的测量。因此，可以在不采样和不分析固体载体的情况下监测生物膜的定殖。
111、本发明的优点在于，它使得可以实施发酵的稀释率，以最大化固定化活性细胞的浓度，而无需在生产期间在生物反应器中进行侵入式采样。因此，在本发明的背景下开发的方法使得可以限制在研究生物膜中梭菌(拜氏梭菌或丙酮丁醇梭菌)生长的动力学期间由固体载体采样引入的偏差：无菌性的损失(也就是说污染的风险)和低氧条件的损失(氧气进入)，其影响所研究细菌的生长。
112、只要至少使用单一类型的细菌菌株，并且只要所使用的细菌菌株具有在所研究的整个发酵过程中固定或变化很小的气体比产率，该方法可以类似地外推/应用于具有固定化细胞的其它类型的发酵。
113、实施例1
114、所描述的系统由工作体积为0.35l的生物反应器1组成。该生物反应器的板件配备有用于进料底物2的入口、用于采样的浸入管、液体出口由溢流系统提供。将聚氨酯泡沫4放置在生物反应器1中，使得每升生物反应器具有0.24l泡沫。系统在120℃的真空下灭菌20分钟。将0.315l体积的无菌和低氧的碳基底物(gapes培养基)引入生物反应器中。含有无菌碳基底物(gapes培养基)的进料容器(图1中未示出)连接到生物反应器1。发酵由拜氏梭菌dsm6423菌株进行。用0.035l该菌株的预培养物进行接种，该预培养物已预先在34℃和低氧条件下培育24小时。
115、一旦进行接种，观察8小时的分批培育期。测试在34℃、200rpm的搅拌下进行，并且发酵的ph不受控制。然后，借助蠕动泵将碳基底物2连续进料至生物反应器1的反应部分v1。碳基底物2的流入体积流量和发酵液(也称为发酵醪料3)的流出体积流量在整个测试过程中是相等的。被生物反应器1的工作体积归一化的流量被称为稀释率。如图1中所示，后者随着测试进程而增加，以免随着生物膜的生长而积累丁醇的抑制性浓度。借助于体积式流量计测量由所使用的菌株产生的气体流量。
116、图6呈现x轴上以小时为单位表示的时间和y轴上的沿左侧垂直轴的每毫升生物反应器反应体积的活微生物浓度，以及沿右侧垂直轴的生物生物反应器的流入2料流和流出3料流(它们相等)的以升/小时为单位表示的流量。
117、-菱形表示每毫升生物反应器体积v1的悬浮活微生物，
118、-圆圈代表根据本发明估计的每毫升生物反应器体积vl的生物膜上的活微生物浓度，
119、-实线曲线表示发酵气体流量的测量值，
120、-虚线曲线表示如上所限定的以h-1为单位的稀释率变化。
121、如图6中所示，所测量的气体体积流量可用于估计发酵培养基中活性细胞的总浓度。因此，可以基于气体测量值以及通过流式细胞术测得的悬浮细胞的存活率的测量值来估计固定在生物反应器中的存活细胞的浓度。
122、这些数据表明，在测试开始时应用于系统的稀释率低时，大多数存活细胞(即活微生物)处于悬浮状态。当稀释率增加时，悬浮的存活细胞被冲洗出生物反应器，尽管气体体积流量保持恒定。然后，对悬浮的存活细胞数量进行计数并分析发酵气体体积流量，使得可以验证大多数存活细胞当时被固定在聚氨酯泡沫上。这些分析然后可以更好地了解存活细胞位于所考虑的生物反应器中的位置，且从而优化发酵方法。
123、因此可以最佳地调节整个发酵过程中的稀释率，这在过程启动时是最特别令人感兴趣的。