背景技术：
1、许多可商购获得的仪器使用电化学发光(ecl)进行分析测量。与ecl标记相互作用并产生ecl的化合物称为ecl共反应物。常用的共反应物包含叔胺(参见例如，us 5,846,485)、草酸盐和用于来自ru(bpy)3+2的ecl的过硫酸盐，以及用于来自鲁米诺(luminol)的ecl的过氧化氢(参见例如，us 5,240,863)。ecl标记产生的光可以用作诊断程序中的报告信号(参见例如，us 5,238,808)。例如，ecl标记可以与检测试剂共价偶联，并且检测试剂参与结合相互作用可以通过测量从ecl标记发射的ecl来监测。可替代地，来自ecl活性化合物的ecl信号可以指示化学环境(参见例如，us 5,641,623，其描述了监测ecl共反应物的形成或破坏的ecl测定)。基于ecl的测定进一步描述于美国专利第5,093,268号；第5,147,806号；第5,324,457号；第5,591,581号；第5,597,910号；第5,641,623号；第5,643,713号；第5,679,519号；第5,705,402号；第5,846,485号；第5,866,434号；第5,786,141号；第5,731,147号；第6,066,448号；第6,136,268号；第5,776,672号；第5,308,754号；第5,240,863号；第6,207,369号；第5,589,136号；以及第6,919,173号和国际公开第wo99/63347号；第wo00/03233号；第wo99/58962号；第wo99/32662号；第wo99/14599号；第wo98/12539号；第wo97/36931号和第wo98/57154号，上述文献中的每一个通过引用整体并入本文。
2、可商购获得的ecl仪器因其灵敏度、动态范围、精度和复杂样品基质的耐受性等而得到广泛应用。若干种类型的商业仪器可用于进行基于ecl的测量(参见例如，debad,j.d.等人,2004.ecl的临床和生物学应用(clinical and biological applications of ecl),《电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence)》.marcel dekker,第43-78页)。ecl仪器进一步描述于例如美国专利第5,935,779号和第5,993,740号(基于珠的ecl测定)；美国专利第6,140,045号；第6,066,448号；第6,090,545号；第6,207,369号和国际公开第wo98/12539号(使用所固定的结合试剂的ecl测定)；美国专利第6,977,722号和第7,842,246号(具有用于ecl测定的集成电极的多孔板)；以及美国公开第2012/0190589号和us2012/0178091(基于盒的ecl测定)中，所述文献中的每一个通过引用整体并入本文。
3、ecl共反应物三丙胺(tpa)通常用于基于ecl的测定。
4、分子信标是为寡核苷酸的分子探针，所述分子信标包含以此类方式相互作用的茎和环、淬灭部分和荧光部分，所述方式即在不存在靶序列的情况下，当荧光部分与后者接近时，所述淬灭部分减少来自所述荧光部分的荧光信号。在理想条件下，此分子探针能够在杂交时产生200倍的荧光增加。然而，此类型的分子信标通常局限于可以在给定时间测定的单个分析物(或在上述情况下，靶序列)。此外，此类具有其荧光部分的分子信标不容易控制，并且由于光漂白而具有有限的寿命。另外地，这些类型的分子信标需要多个温育和洗涤循环，所述温育和洗涤循环可能延长测定的持续时间，并且因此降低效率。具有ecl标记的分子信标探针的实例公开于《化学通讯(chem.commun.)》21:2710-2711(2003)以及《传感器和执行器b-化学(sensors&actuators:b.chemical)》330:129261(2021)。
技术实现思路
1、本公开的实施例包含一种电化学发光(ecl)检测方法，其包括：
2、a)提供基材，所述基材包括电极并且具有固定在所述基材的表面上的结合试剂；
3、b)使所述基材与组合物接触，所述组合物包括：
4、i)结合配偶体和/或结合复合物，所述结合配偶体和/或结合复合物包括寡核苷酸，其中所述结合试剂与所述结合配偶体和/或结合复合物结合；
5、ii)多个ecl标记的寡核苷酸探针，所述多个ecl标记的寡核苷酸探针包括与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列；以及
6、iii)ecl共反应物，所述ecl共反应物不是tpa；
7、c)允许所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的一部分与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交，其中所述结合配偶体和/或结合复合物被所述结合试剂结合，并且其中所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的另一部分不与被所述结合试剂结合的所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交；
8、d)选择性地去淬灭所述多个ecl标记的探针的与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交的所述部分；
9、e)向所述电极施加电压以产生ecl；以及
10、f)测量所述ecl，其中在施加所述电压和测量所述ecl之前，所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的未与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交的所述部分未从所述组合物中去除。
11、在实施例中，b)使所述基材与所述组合物接触包括：
12、b')使所述基材与包括所述结合配偶体和/或结合复合物的组合物接触；
13、b”)使所述基材与包括所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的组合物接触；以及
14、b”')使所述基材与包括所述ecl共反应物的组合物接触。
15、在实施例中，步骤b')、b”)和b”')中的每个步骤依序进行。在实施例中，步骤b')、b”)和b”')中的至少两个步骤同时进行。在实施例中，所述方法包括：
16、b')使所述基材与包括所述结合配偶体和/或结合复合物的第一组合物接触，并且允许所述结合配偶体和/或结合复合物通过与所述结合试剂结合而固定在所述表面上；以及
17、b”)使包括所固定的结合配偶体和/或结合复合物的所述基材与包括所述多个ecl标记的寡核苷酸探针和所述ecl共反应物的第二组合物接触；或
18、b')使所述基材与包括所述结合配偶体和/或结合复合物的第一组合物和所述多个ecl标记的寡核苷酸探针接触，其中所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的一部分与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交，并且允许所述结合配偶体和/或结合复合物通过与所述结合试剂结合而固定在所述表面上；以及
19、b”)使包括所述所固定的结合配偶体和/或结合复合物的所述基材与包括所述ecl共反应物的第二组合物接触；或
20、b')使所述基材与包括所述结合配偶体和/或结合复合物的第一组合物接触，并且允许所述结合配偶体和/或结合复合物通过与所述结合试剂结合而固定在所述表面上；以及
21、b”)使包括所述所固定的结合配偶体和/或结合复合物的所述基材与包括所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的第二组合物接触，并且允许所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的一部分与所述所固定的结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交；以及
22、b”')使所述基材与包括所述ecl共反应物的第三组合物接触。
23、在实施例中，其进一步包括在所述使所述基材与所述结合配偶体和/或结合复合物接触之后洗涤所述基材，以去除未被所述结合试剂结合的结合配偶体和/或结合复合物，其中所述洗涤是在使所述基材与包括所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的所述组合物接触之前进行的。
24、本公开的实施例包含一种电化学发光(ecl)检测方法，其包括：
25、a)提供基材，所述基材包括电极并且具有包括固定在所述基材的表面上的寡核苷酸的结合配偶体和/或结合复合物；
26、b)使所述基材与组合物接触，所述组合物包括：
27、i)多个ecl标记的寡核苷酸探针，所述多个ecl标记的寡核苷酸探针包括与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列；以及
28、ii)ecl共反应物，所述ecl共反应物不是tpa；
29、c)允许所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的一部分与所固定的结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交，并且其中所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的另一部分不与所述所固定的结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交；
30、d)选择性地去淬灭所述多个ecl标记的探针的与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交的所述部分；
31、e)向所述电极施加电压以产生ecl；以及
32、f)测量所述ecl，其中在施加所述电压和测量所述ecl之前，所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的未与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交的所述部分未从所述组合物中去除。
33、在实施例中，b)使所述基材与所述组合物接触包括：
34、b')使所述基材与包括所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的组合物接触；以及
35、b”)使所述基材与包括所述ecl共反应物的组合物接触。
36、在实施例中，步骤b')和b”)中的每个步骤依序进行。在实施例中，步骤b')和b”)中的每个步骤同时进行，任选地其中所述多个ecl标记的寡核苷酸探针和所述ecl共反应物在单一组合物中。
37、本公开的实施例，包含前述段落中的实施例，包含其中所述结合配偶体和/或结合复合物包括分析物的实施例。在实施例中，所述分析物包括肽。在实施例中，所述分析物包括寡核苷酸。在实施例中，所述分析物是所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸。在实施例中，用所述寡核苷酸标记所述分析物。在实施例中，通过将所述分析物与包括所述寡核苷酸的检测试剂结合来用所述寡核苷酸标记所述分析物。在实施例中，所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸包括与所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的所述寡核苷酸序列互补的所述序列的多个拷贝。在实施例中，在使所述基材与所述多个ecl标记的寡核苷酸探针接触之前，进行扩增反应以产生与所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的所述寡核苷酸序列互补的所述序列的所述多个拷贝。在实施例中，通过将所述分析物与包括寡核苷酸引物的检测试剂结合来用所述寡核苷酸标记所述分析物，并且其中所述寡核苷酸引物通过聚合酶延伸以产生包括与所述ecl标记的寡核苷酸探针的所述寡核苷酸序列互补的所述序列的所述多个拷贝的寡核苷酸。在实施例中，所述扩增反应或引物延伸是滚环扩增反应。在实施例中，所述ecl标记的寡核苷酸探针包含茎环或发夹结构、ecl标记和淬灭部分，其中所述淬灭部分靠近所述ecl标记，并且当所述寡核苷酸探针呈茎环或发夹构型时淬灭所述ecl标记，但当所述茎环或发夹结构呈开放构型时不淬灭所述ecl标记，并且其中所述选择性地去淬灭包括将所述多个ecl标记的寡核苷酸探针的所述部分与呈所述开放构型的所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交。在实施例中，所述ecl标记的寡核苷酸探针包括ecl标记和淬灭部分，其中所述淬灭部分靠近所述ecl标记，并且当所述寡核苷酸探针呈线性确认时淬灭所述ecl标记，其中所述选择性地去淬灭包括仅从所述多个ecl标记的探针的与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交的所述部分选择性地切割所述淬灭部分，使得所述淬灭部分被释放到溶液中并且不再靠近经杂交的ecl标记的探针的所述ecl标记，在切割所述淬灭部分后，所述经杂交的ecl标记的探针保持与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交。在实施例中，所述切割通过酶进行。在实施例中，所述酶选自由以下组成的组：切口限制性核酸内切酶、rna酶h2和具有5'核酸外切酶活性的聚合酶。在实施例中，所述酶仅切割所述ecl标记的寡核苷酸探针，由此使所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸保持完整。在实施例中，所述酶是识别所述经杂交的ecl标记的探针中的序列的切口限制性核酸内切酶，或识别所述经杂交的ecl标记的探针中的rna碱基的rna酶h2。在实施例中，所述酶是具有5'核酸外切酶活性的聚合酶，并且其中所述方法进一步包括：在所述经杂交的ecl标记的探针的位置5'处将引物与所述结合配偶体和/或结合复合物的所述寡核苷酸杂交，允许所述具有5'核酸外切酶活性的聚合酶将所述引物延伸到所述经杂交的ecl标记的探针，其中所述5'核酸外切酶活性切割所述经杂交的ecl标记的探针的所述淬灭部分，并且其中所述ecl标记的探针包括对所述5'核酸外切酶活性具有抗性的部分。在实施例中，所述ecl共反应物选自由以下组成的组：3-(二正丙基氨基)-丙磺酸；4-(二正丙基氨基)-丁磺酸；4-[双-(2-羟基乙烷)-氨基]-丁磺酸；哌啶-n-(3-丙磺酸)；氮杂环庚烷-n-(3-丙磺酸)；哌啶-n-(3-丙酸)(ppa)；3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(mopso)；3-吗啉丙磺酸(mops)；n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-3-丙磺酸(epps)；n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-3-乙磺酸(bes)；哌嗪-n,n'-双(2-乙磺酸)(pipes)；三乙醇胺(tea)；n-2-羟基哌嗪-n-2-乙磺酸(hepes)；哌嗪-n,n'-双-4-丁磺酸；高哌啶-n-3-丙磺酸；哌嗪-n,n'-双-3-丙磺酸；哌啶-n-3-丙磺酸；哌嗪-n-2-羟基乙烷-n'-3-甲基丙酸酯；哌嗪-n,n'-双-3-甲基丙酸酯；1,6-二氨基己烷-n,n,n',n'-四乙酸；n,n-双丙基-n-4-氨基丁磺酸；n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(tes)；1,3-双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷(双-三丙烷)；3-二甲基氨基-1-丙醇；3-二甲基氨基-2-丙醇；n,n,n',n'-四丙基丙烷-1,3-二胺(tpa二聚体)；哌嗪-n,n'-双(2-羟基丙烷)磺酸(popso)和2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]丙烷-1-磺酸(heppso)、正丁基二乙醇胺(bdea)、2-二丁基氨基乙醇(dbae)、叔丁基二乙醇胺(tbdea)、甲基二乙醇胺(mdea)、3-[双-(2-羟基-乙基)-氨基]-丙烷-1-磺酸(dea-ps)以及其组合。在实施例中，所述ecl共反应物是tea，或选自由以下组成的组：tea、tbdea、bdea、mdea、dea-ps和其组合；选自由以下组成的组：tea、tbdea、mdea、dea-ps和其组合；或选自由以下组成的组：tea、tbdea、mdea、dea-ps和其组合。在实施例中，所述淬灭部分选自由以下组成的组：atto 540q、atto 575q、atto 580q、atto 612q、iowa black fq、iowa back rq、qsy 21、irdye qc-1、bhq0、bhq1、bhq-2、bhq-3、dabcyl、qsy 7、qsy 9、qsy 21、qsy 35、qxl 490、qxl520、qxl 570、qxl 670、二茂铁、铁联吡啶和其组合。在实施例中，所述ecl标记是包括钌、锇、铱、铼和/或镧系金属的有机金属络合物。所述ecl标记包括三(联吡啶)钌或改性三(联吡啶)钌。所述ecl标记包括式ii中示出的化学结构：
38、在实施例中，所述共反应物在根据上文和本文的实施例中任一项所述的组合物中。在实施例中，所述共反应物在带编号的项1至69中任一项所述的组合物中。在实施例中，所述共反应物包括tea。