一种美登素新型衍生物及其生物合成方法与应用

本发明涉及一种美登素新型衍生物及其生物合成方法与应用，属于微生物制药。

背景技术：

1、安丝菌素(ansamitocins)是一类由微生物产生的美登素类化合物，具有极高的细胞毒性。安丝菌素通过与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管蛋白的聚合，抑制肿瘤细胞的有丝分裂导致细胞死亡。安丝菌素目前主要由珍贵束丝放线菌(actinosynnemapretiosum)atcc 31565或atcc 31280及其衍生菌株通过工业发酵生产，其发酵主产物安丝菌素p-3(ap-3)先还原脱去c-3位酯基获得关键中间体美登醇，再用于美登素类抗体偶联药物(如t-dm1)的合成。然而，目前ap-3的发酵产量不高，同时存在p-2、p-4、pnd、agp和acgp等同系物杂质，导致分离纯化工艺复杂，成本居高不下。

2、安丝菌素p-3的生物合成以3-氨基-5-羟基苯甲酸(ahba)为起始单元，由i型聚酮合酶催化聚酮链的延伸，包括3个乙酸单元、3个丙酸单元和1个甲氧基延伸单元，随后经酰胺合酶环化形成19元大环内酰胺，最后经过一系列后修饰反应，包括氯代、20-o-甲基化、氨甲酰基环化、3-o-酰基化、环氧化和酰胺n-甲基化形成安丝菌素。关键后修饰酶3-o-酰基转移酶asm19的酰基供体底物杂泛性是安丝菌素同系物杂质形成的主要原因，但是，由于最后三步后修饰的催化时序，敲除asm19基因并不能积累美登醇，而是积累n-去甲基-4,5-去环氧美登醇(ddm)。通过外源添加缬氨酸、异丁酸钠或异丁醇等提高内源异丁酰基的供给，可使ap-2和ap-4等同系物杂质降至10％以下，但无法完全消除。

3、来源于拟无枝酸菌(ansacarbamitocins)基因簇的氨甲酰基转移酶asc21b具有严格酰基供体特异性，使用其代替asm19，可以有效消除c-3位的酰基多样性，但由于催化最后一步后修饰的酰胺n-甲基转移酶asm10并不能有效识别氨甲酰化的底物，只能形成n-去甲基-3-o-氨甲酰美登醇。因此，筛选能够识别n-去甲基-3-o-氨甲酰美登醇并高效催化酰胺n甲基化的酶基因，将其用于安丝菌素生物合成途径的遗传改造，合成3-o-氨甲酰美登醇对于安丝菌素类的组分简化，降低美登素类原料药的成本具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种美登素新型衍生物及其生物合成方法与应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种美登素新型衍生物3-o-氨甲酰美登醇，其化学结构如下所示：

4、

5、一种用于生物合成上述3-o-氨甲酰美登醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌的代谢产物中含有上式所示的3-o-氨甲酰美登醇。

6、根据本发明优选的，所述工程菌同时表达负责c-3位修饰的3-o-氨甲酰基转移酶和负责酰胺n-甲基化修饰的甲基转移酶；所述3-o-氨甲酰基转移酶的编码基因为asc21b，核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.6所示；所述甲基转移酶的编码基因为pba295、pba296、pba304或nan291，核苷酸序列依次如seq id no.2～5所示，氨基酸序列依次如seq id no.7～10所示。

7、上述用于生物合成3-o-氨甲酰美登醇的工程菌的构建方法，步骤如下：

8、(1)以白色拟无枝酸菌(amycolatopsis alba)dsm 44262的基因组dna为模板进行高保真pcr扩增，得到两端分别引入ndei和nhei酶切位点的asc21b基因片段，pcr产物经ndei和nhei双酶切后，与载体puc-kasop*-t-ndei/nhei连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，经验证和提取获得质粒puc-asc21b；

9、(2)以拟诺卡氏菌(nocardiopsisansamitocini)egi80425基因组dna为模板进行高保真pcr扩增，获得两端分别引入ndei和nhei酶切位点的nan291基因片段，pcr产物经ndei和nhei双酶切，得到nan291-ndei/nhei片段；人工合成两端引入ndei和spei酶切位点的sam依赖型甲基转移酶pba295，pba296和pba304基因，克隆于puc57载体中，经ndei和spei双酶切获得pba295-ndei/spei、pba296-ndei/spei和pba304-ndei/spei片段；将nan291-ndei/nhei、pba295-ndei/spei、pba296-ndei/spei和pba304-ndei/spei片段分别与载体片段puc-kasop*-t-ndei/nhei连接，连接产物分别转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，经验证和提取获得质粒puc-pba295、puc-pba296、puc-pba304和puc-nan291；

10、(3)质粒puc-asc21b经mfei和spei双酶切后获得asc21b-mfei/spei片段；质粒puc-pba295、puc-pba296、puc-pba304和puc-nan291经xbai和psti双酶切后获得pba295-xbai/psti、pba296-xbai/psti、pba304-xbai/psti和nan291-xbai/psti片段；将asc21b-mfei/spei和载体片段p15acis-ecori/psti分别与pba295-xbai/psti、pba296-xbai/psti、pba304-xbai/psti、nan291-xbai/psti连接，获得表达质粒p15acis-asc21b-pba295、p15acis-asc21b-pba296、p15acis-asc21b-pba304和p15acis-asc21b-nan291；

11、(4)将步骤(3)得到的表达质粒分别电转化至大肠杆菌et12567/puz8002感受态细胞中，再通过接合转移分别导入ddm产生菌hgf052中，经接合子纯化和pcr验证后，获得用于生产3-o-氨甲酰美登醇的工程菌hgf052-asc21b-pba295、hgf052-asc21b-pba296、hgf052-asc21b-pba304和hgf052-asc21b-nan291。

12、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述pcr扩增引物序列如下：

13、ndei-asc21b-f:5’-gaggcggacatatgctggtgctcggactgaac-3’，

14、nhei-asc21b-r:5’-cccgagtcagctagctcaggccggagtgagggtgaag-3’；

15、pcr扩增条件：预变性，95℃10min；变性，95℃30sec，退火，65℃30sec，延伸，72℃2min，35个循环；终延伸，72℃5min。

16、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述pcr扩增引物序列如下：

17、ndei-nan291-f:5’-gaggcggacatatggtgctggaacacgaacg-3’，

18、nhei-nan291-r:5’-cgcccgagtcagctagcctggacacgggtgtccccttg-3’；

19、pcr扩增条件：预变性，95℃10min；变性，95℃30sec，退火，72℃30sec，延伸，72℃1min，35个循环；终延伸，72℃5min。

20、本发明中，所述载体片段puc-kasop*-t-ndei/nhei和p15acis-kasop*-t-ndei/nhei经ndei和nhei双酶切质粒puc-kasop*-t和p15acis-kasop*-t后获得；载体片段p15acis-ecori/psti经ecori和psti双酶切质粒p15acis-kasop*-t后获得。所述质粒puc-kasop*-t为现有质粒。

21、所述质粒p15acis-kasop*-t按照如下方法构建：以质粒pset152为模板，gbcis-f/r为引物，通过pcr扩增获得安普霉素抗性基因和整合元件片段；再以质粒p15a-cm-ccdb为模板，gb15aori-f/r为引物，通过pcr扩增获得p15a复制区片段；ecori和psti双酶切puc-kasop*-t，获得kasop*-t-ecori/psti片段；上述三片段进行gibson拼接，连接体系转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，经验证和提取获得质粒p15acis-kasop*-t；

22、所述质粒p15acis-kasop*-t构建过程中，pcr引物序列如下：

23、gbcis-f:5’-acactccgctagggcataagggattttggtcatgag-3’

24、gbcis-r:5’-gaaacaattgggaattccgatctttgtagaaaccatc-3’

25、gb15aori-f:5’-gtaatgcataactgcagacaacttatatcgtatggggctg-3’

26、gb15aori-r:5’-gccctagcggagtgtatactg-3’

27、pcr扩增条件：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec，退火，53℃30sec，延伸，72℃4min或1min，35个循环；终延伸，72℃5min。

28、本发明中sam依赖型甲基转移酶基因pba295、pba296、pba304的全基因合成参照现有技术进行，所述载体puc57为现有质粒载体。

29、本发明中所述ddm产生菌hgf052为珍贵束丝放线菌atcc 31565的asm19敲除突变株，来自文献(journal of american chemical society，2002，124(23)，6544-6545)。

30、上述美登素新型衍生物3-o-氨甲酰美登醇的制备方法，包括步骤如下：

31、1)将上述工程菌接种于ymg固体培养基上，在25～35℃下扩大培养5～10天；

32、2)将工程菌的ymg固体培养物切块，用提取液乙酸乙酯浸泡提取3次后合并浸提液，将浸提液减压浓缩至200～400ml后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，将萃取后的乙酸乙酯相合并后经减压浓缩至干，得到乙酸乙酯提取物；

33、3)乙酸乙酯提取物经等体积石油醚和甲醇萃取后得甲醇相和石油醚相，甲醇相经减压浓缩后经葡聚糖凝胶柱层析分离得到粗产物，粗产物经hplc制备得到如上式所示3-o-氨甲酰美登醇。

34、根据本发明优选的，步骤1)中，所述扩大培养为8l扩大培养，培养条件为30℃，8d。

35、根据本发明优选的，步骤1)中，所述ymg固体培养基配方为：酵母提取物0.4％，麦芽提取物1％，葡萄糖0.4％，10n naoh调ph值至7.2-7.4，1.5-2％琼脂，115℃高压灭菌30min。

36、上述美登素新型衍生物3-o-氨甲酰美登醇在制备抗肿瘤药物中的应用。

37、经药理试验研究显示，本发明提供的3-o-氨甲酰美登醇对人乳腺癌细胞(mda-mb-231)、人宫颈癌细胞(hela)和人结肠癌细胞(hct116)有细胞毒活性，ic50值分别为5.85、0.32和1.24μm，可用于制备抗肿瘤药物。优选的，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌或结肠癌。

38、本发明未详尽之处，均可采用现有技术。

39、本发明的有益效果在于：

40、1、经体外抗肿瘤活性实验表明，本发明提供的3-o-氨甲酰美登醇对人乳腺癌细胞(mda-mb-231)、人宫颈癌细胞(hela)和人结肠癌细胞(hct116)显示了明显的细胞毒活性，ic50值分别为5.85、0.32和1.24μm，因此可用于制备抗肿瘤药物。

41、2、本发明提供的美登素新型衍生物3-o-氨甲酰美登醇可通过现有技术还原为美登醇，用于美登素抗体偶联药的制备，因此可替代ap-3成为新的美登素类药物原料。

42、3、本发明发现了来源于宏基因组和拟诺卡氏菌egi80425的sam依赖型甲基转移酶基因pba295、pba296、pba304和nan291，其与氨甲酰基转移酶asc21b共表达可实现美登素新型衍生物3-o-氨甲酰美登醇的高效合成，有效解决了内源n-甲基转移酶asm10不能识别并催化n-去甲基-3-o-氨甲酰美登醇，无法制备3-o-氨甲酰美登醇的问题。