汗腺细胞的培养获得汗腺类器官的方法及其应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种汗腺细胞的培养方法，特别是涉及一种汗腺细胞的培养获得汗腺类器官的方法及其在汗腺损伤的皮肤修复中的应用。

背景技术：

1、汗腺，作为人体最大器官-皮肤的附属器官，主要在调节体温、平衡体液以及物质代谢等方面发挥重要的作用。汗腺发生于胚胎时期，出生后，当汗腺结构遭遇破坏时，例如轻度烧伤，汗腺可以以其深部未受创的部分为模板完全修复受损的汗腺，而当汗腺结构遭遇完全破坏时，汗腺是无法再生的，例如在严重的深度烧伤后，创面愈合处缺乏汗腺结构，患者无法再恢复其创伤处的发汗功能。尽管随着医疗技术的发展，大面积烧伤的生存率大大提高，但是患者预后还是面临汗腺功能缺失，严重降低患者愈后的生活质量。此外，还存在多种伴有皮肤汗腺发育异常与功能障碍的遗传性疾病，目前无法通过现有治疗手段恢复汗腺的正常结构与功能。因此，促进患处汗腺功能重建已成为皮肤创面愈合过程中欲待解决的一个重要问题。

2、近年来，随着干细胞生物学与再生医学研究的深入，干细胞治疗显示出良好的促组织再生能力，干细胞技术为汗腺再生带来了新的希望。应用干细胞技术促进汗腺再生，需要解决两个关键问题。一是细胞的来源，所获得的细胞不但需具有较强的增殖能力，还必须具备分化为汗腺细胞、发挥汗腺功能的潜力。目前使用胚胎干细胞、表皮干细胞、间充质干细胞(骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞)以及毛囊干细胞向汗腺进行诱导分化的研究均有报道。但是这些研究均存在控制干细胞的分化方向困难、分化效率低下的问题。这些问题限制了上述干细胞作为汗腺种子细胞的应用。据报道虽然出生前汗腺的数量已经被决定，但是成体依然存在一定数量的汗腺干细胞。因此，如能短期内大量扩增这些汗腺干细胞，无疑将是促进汗腺再生最为理想的种子细胞。二是细胞的培养方式，不但需要满足细胞移植的数目，并且需要保持细胞分化为有功能的汗腺细胞的能力。近些年来，类器官的研究发展迅速，类器官被《nature methods》杂志评为2017年生物科学领域年度技术，具体是指包含其代表器官关键特性的三维细胞培养物。体外培养系统基于自我更新的干细胞群，分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间结构并重现对应器官的部分功能，从而提供高度生理/病理相关系统。到目前为止，大部分机体的组织和器官都有建立类器官培养体系的相关报道，如大脑、小肠、肝脏、胰腺等等。类器官培养方法的成功建立，加速了组织器官的发育与疾病研究。另一方面，在合适的条件下，类器官可以实现多代数传代，实现细胞数目的扩增，为细胞治疗提供种子细胞。但是目前为止还未有关于汗腺的体外类器官研究报道，归其原因，可能是对汗腺的发育及调控研究机制尚未明确，培养体系难以建立。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种使用汗腺细胞培养汗腺类器官的方法，其包括以下步骤：

2、t1：将汗腺细胞用基质胶进行重悬，得到重悬的汗腺细胞；和

3、t2：利用三维培养基对重悬的汗腺细胞进行培养，收集培养后的三维汗腺样结构即为培养的汗腺类器官；

4、其中所述三维培养基的配方包括以下组分：advanced dmem/f-12培养基、0.01％-1％白蛋白、0.2％-10％b-27添加剂、1-50mm hepes、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、10-1000u/ml青霉素和0.01-1mg/ml链霉素。

5、在一些实施方式中，所述三维培养基的配方包括以下组分：advanced dmem/f-12培养基、0.1％白蛋白、2％b-27添加剂、10mm hepes、1％谷氨酰胺添加剂、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。

6、在一些实施方式中，步骤t1中，所述基质胶为matrigel或bme；所述基质胶的浓度为6-9mg/ml；所述重悬的汗腺细胞中汗腺细胞的浓度为1×102个/ml-2×103个/ml。

7、在一些实施方式中，步骤t2中，所述培养的条件为：37℃、5％ co2培养箱中培养，培养时间为5-12天，其中每3天更换所述三维培养基一次；优选地，所述培养时间为5-7天。

8、在一些实施方式中，所述三维培养基的配方还包括以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、eda信号通路激动剂、sirt1蛋白抑制剂、wnt信号通路激动剂、tgfβ信号通路抑制剂、腺苷酸环化酶激动剂、bmp4信号通路激动剂。

9、在一些实施方式中，所述抗氧化剂为n-乙酰基-l-半胱氨酸，浓度为0.1-10mm；所述表皮细胞生长因子为egf，浓度为5-200ng/ml；所述碱性成纤维细胞生长因子为bfgf，浓度为2-200ng/ml；所述eda信号通路激动剂为eda，浓度为2-200ng/ml；所述sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mm；所述wnt信号通路激动剂为wnt3a，浓度为10-1000ng/ml；所述tgfβ信号通路抑制剂为a83-01，浓度为0.1-10μm；所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林fsk，浓度为1-100μm；所述bmp4信号通路激动剂为bmp4，浓度为2-200ng/ml。

10、本发明另一方面提供一种用于上述的方法中的三维培养基，其配方包括以下组分：advanced dmem/f-12培养基、0.01％-1％白蛋白、0.2％-10％b-27添加剂、1-50mmhepes、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、10-1000u/ml青霉素和0.01-1mg/ml链霉素。

11、在一些实施方式中，所述培养基的配方包括以下组分：advanced dmem/f-12培养基、0.1％白蛋白、2％b-27添加剂、10mm hepes、1％谷氨酰胺添加剂、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。

12、在一些实施方式中，所述三维培养基的配方还包括以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、eda信号通路激动剂、sirt1蛋白抑制剂、wnt信号通路激动剂、tgfβ信号通路抑制剂、腺苷酸环化酶激动剂、bmp4信号通路激动剂。

13、在一些实施方式中，所述抗氧化剂为n-乙酰基-l-半胱氨酸，浓度为0.1-10mm；所述表皮细胞生长因子为egf，浓度为5-200ng/ml；所述碱性成纤维细胞生长因子为bfgf，浓度为2-200ng/ml；所述eda信号通路激动剂为eda，浓度为2-200ng/ml；所述sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mm；所述wnt信号通路激动剂为wnt3a，浓度为10-1000ng/ml；所述tgfβ信号通路抑制剂为a83-01，浓度为0.1-10μm；所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林fsk，浓度为1-100μm；所述bmp4信号通路激动剂为bmp4，浓度为2-200ng/ml。

14、在一些实施方式中，所述三维培养基的配方选自以下配方中的任一种：

15、配方1：在advanced dmem/f-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％b-27添加剂、10mmhepes、1％谷氨酰胺添加剂、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素；

16、配方2：在advanced dmem/f-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％b-27添加剂、10mmhepes、1％谷氨酰胺添加剂、1mm n-乙酰基-l-半胱氨酸、50ng/ml egf、20ng/ml bfgf、20ng/ml eda、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素；

17、配方3：在advanced dmem/f-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％b-27添加剂、10mmhepes、1％谷氨酰胺添加剂、1mm n-乙酰基-l-半胱氨酸、10mm尼克酰胺、20ng/ml eda、50ng/ml egf、20ng/ml bfgf、100ng/ml wnt3a、1μm a83-01、10μm fsk、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素；

18、配方4：在advanced dmem/f-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％b-27添加剂、10mmhepes、1％谷氨酰胺添加剂、1mm n-乙酰基-l-半胱氨酸、10mm尼克酰胺、20ng/ml eda、50ng/ml egf、20ng/ml bfgf、100ng/ml wnt3a、1μm a83-01、10μm fsk、20ng/ml bmp4、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素。

19、本发明又一方面提供一种汗腺类器官，其根据上述的方法培养获得。该汗腺类器官在制备用于修复皮肤全层损伤和/或汗腺缺损的产品中的应用也属于本发明的内容。

20、基于以上技术方案，汗腺细胞能在本发明提供的三维培养条件下培养获得汗腺类器官，其具有类似汗腺的形态，且保持较强的干细胞特性，能够短期内扩增得到大量的汗腺类器官，汗腺类器官具有双向分化潜能，能分化得到表皮细胞和汗腺细胞，可用于制备促进全层损伤小鼠的皮肤创面愈合以及汗腺受损小鼠的汗腺再生及功能恢复的药物或产品，应用前景广阔。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、1)本发明利用汗腺细胞通过三维培养获得的汗腺类器官细胞活力高，连续培养传代30天后仍然有大部分细胞存活，仅有少量细胞死亡；培养一段时间后形成的汗腺类器官可表达ck14、ki67(细胞增殖标志物，说明汗腺类器官细胞具有较强的增殖能力)、αsma和sox9蛋白，可见培养获得的汗腺类器官仍具有干细胞特性；且与汗腺细胞相比，干性组分表达升高，分化组分表达下降，表明通过三维培养，富集了汗腺干/祖细胞，并且可以在短期内扩增得到大量的汗腺种子细胞，建立了有效培养获得汗腺类器官的方法；

22、2)本发明通过三维培养获得的汗腺类器官既含有汗腺干/祖细胞又含有部分成熟汗腺细胞，其具有双向分化潜能，可分化得到汗腺细胞和表皮细胞，移植到足底和背部全层损伤小鼠后不仅能够促进汗腺的再生及功能的恢复，而且可以促进皮肤创面的愈合，能用于制备修复皮肤损伤并且恢复附属器官功能的细胞产品，应用前景广阔；

23、3)本发明首次提供一种用于培养汗腺细胞获得汗腺类器官的三维培养基，采用的是基质胶与细胞混合培养的方式，在advanced dmem/f-12培养基的基础上添加其他组分，培养得到的汗腺类器官细胞活性高，且干性组分高。传统二维培养汗腺细胞使得汗腺细胞失去了在体的生物学特性，而本发明通过三维培养生成的汗腺类器官，是由汗腺干细胞和成熟细胞构成的类器官组织，在形态结构上类似在体的汗腺组织，维持和保留了在体汗腺的生物学特性；另一方面，应用本发明筛选的三维汗腺培养体系，短期内可以得到大量的汗腺类器官，因此提供了一个理想的汗腺细胞种子资源。