一种猴痘病毒B6R抗原及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种猴痘病毒b6r抗原及其制备方法与应用。

背景技术：

1、猴痘是一种由猴痘病毒(monkeypox virus，mpxv)感染所致的人兽共患病毒性疾病，临床上主要表现为发热、皮疹、淋巴结肿大，该病主要流行于中非和西非。2022年5月以来，一些非流行国家也陆续报道了猴痘病例，并存在社区传播风险。因此受到多个国家卫生监管部门的关注。

2、猴痘病毒颗粒呈砖形或椭圆形，大小为200nm×250nm，有包膜，病毒颗粒中有结构蛋白和dna依赖的rna多聚酶，基因组为双链dna，长度约197kb。猴痘病毒基本的感染形态为成熟病毒粒子(mature virion，mv)，此外，还有一种形态：成熟病毒粒子外还包绕有一层来源于内质网膜的脂质膜(extracellular enveloped，ev)。其中，b6r抗原为包裹脂质膜猴痘病毒成熟病毒粒子(ev)的膜蛋白，调节病毒粒子进入宿主细胞，也是重要的免疫靶点之一。因此，制备b6r蛋白为猴痘病毒检测试剂或疫苗的关键产品研发的关键步骤。

技术实现思路

1、本发明所要解决的主要问题是如何制备猴痘病毒b6r抗原。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种荧光素酶信号肽(信号肽ga，seq idno.1)，信号肽ga可引导猴痘病毒b6r抗原分泌至培养上清，经过镍柱亲和层析即可获得高纯度抗原，且其分泌表达产量显著高于高于天然信号肽(信号肽ns)和抗体轻链信号肽(信号肽lc)。

3、本发明首先提供了一种融合蛋白。

4、本发明提供的融合蛋白为将氨基酸序列是seq id no.1的多肽融合于猴痘病毒b6r抗原的n端得到的蛋白质。

5、进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列为seq id no.5、seq id no.5的第1-275位或seq id no.5第1-280位。

6、seq id no.5的第1-17位为信号肽ga(即seq id no.1)，第18-275位为所述猴痘病毒b6r抗原，第276-280位为linker接头，第281-286位为组氨酸标签。

7、本发明还提供了编码上述融合蛋白的核酸分子。

8、进一步地，所述核酸分子自5’端到3’端依次由上述多肽的编码基因和猴痘病毒b6r抗原的编码基因组成。

9、更进一步地，所述多肽的编码基因可为如下任一：

10、(a1)编码链的核苷酸序列是seq id no.2的dna分子；

11、(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码所述多肽的dna分子；

12、(a3)与(a1)或(a2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述多肽的dna分子。

13、更进一步地，所述猴痘病毒b6r抗原的编码基因可为如下任一：

14、(b1)编码链的核苷酸序列是seq id no.4所示的dna分子；

15、(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码相同蛋白质的dna分子；

16、(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码相同蛋白质的dna分子。

17、更加具体地，所述核酸分子可为编码链的核苷酸序列是seq id no.7、seq idno.7的第1-840位或seq id no.7的第1-855位。

18、seq id no.7的第1-6位为hindiii识别位点，7-15位为kozak序列，16-66位为荧光素酶信号肽ga编码基因，第67-840位为b6r抗原编码基因，第841-855位为连接肽(linker，接头)基因，第856-873位为组氨酸标签基因，第874-876位为终止密码子，第877-884位为paci识别位点。重组表达质粒pcgs3-ga-b6r含有重组蛋白ga-b6r的编码基因，重组蛋白ga-b6r的编码基因的编码序列是seq idno.7的第16位-876位，重组蛋白ga-b6r的编码基因编码氨基酸序列是序列5的蛋白质。

19、上述核酸分子或编码基因中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

20、上述核酸分子或编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％ sds和1×ssc，0.1％ sds各洗膜一次。

21、本发明还提供了上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

22、其中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述融合蛋白的dna，该dna不仅包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

23、在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将seq id no.7所示dna片段(seqid no.5的第16-66位为信号肽ga的编码基因，即seq id no.2)插入到pcgs3载体的多克隆位点(如hindiii和paci)后得到的重组质粒。相应地，所述转基因细胞系为将所述重组质粒导入到expi293f细胞后所得。

24、本发明还提供了上述融合蛋白或所述的核酸分子或所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在如下任一中的应用：

25、p1、提高猴痘病毒b6r抗原在宿主细胞中的分泌表达产量中的应用；

26、p2、提高猴痘病毒b6r抗原在宿主细胞中的分泌表达效率中的应用；

27、p3、制备猴痘病毒b6r抗原分泌蛋白制品中的应用。

28、所述猴痘病毒b6r抗原分泌蛋白的氨基酸序列是seq id no.5。

29、其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。

30、进一步地，所述真核宿主细胞可为hek293细胞，cho细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。

31、在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为expi293f细胞。

32、制备猴痘病毒b6r抗原分泌蛋白的方法也属于本发明要求保护的范围。

33、本发明要求保护的制备猴痘病毒b6r抗原分泌蛋白的方法，可包括如下步骤：

34、(a1)将前文所述的核酸分子导入宿主细胞，得到重组细胞；

35、(a2)培养所述重组细胞，从培养上清中获得猴痘病毒b6r抗原分泌蛋白。

36、其中，所述核酸分子可通过前文所述重组载体导入所述宿主细胞。

37、步骤(a1)中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。如：hek293细胞，cho细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。

38、在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为expi293f细胞。

39、步骤(a2)中，所述培养为培养至细胞活率降至65％-75％时终止培养。

40、步骤(a2)中，是按照包括如下步骤的方法从所述培养上清中获得猴痘病毒b6r抗原分泌蛋白：收集培养物于3500g离心30min，收集上清进行超滤浓缩和镍柱纯化。

41、本发明还提供了氨基酸序列是seq id no.1的多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：

42、p1、提高猴痘病毒b6r抗原在宿主细胞中的分泌表达产量中的应用；

43、p2、提高猴痘病毒b6r抗原在宿主细胞中的分泌表达效率中的应用；

44、p3、制备猴痘病毒b6r抗原分泌蛋白制品中的应用；

45、所述相关生物材料为seq id no.1所述多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。

46、在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将seq id no.7所示dna片段(seqid no.5的第16-66位为信号肽ga的编码基因，即seq id no.2)插入到pcgs3载体的多克隆位点(如hind iii和pac i)后得到的重组质粒。

47、进一步地，所述宿主细胞可为真核宿主细胞，如：hek293细胞，cho细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。

48、在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为expi293f细胞。

49、进一步地，所述编码基因可为如下任一：

50、(a1)编码链的核苷酸序列是seq id no.2的dna分子；

51、(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码seq id no.1所示多肽的dna分子；

52、(a3)与(a1)或(a2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述多肽的dna分子。

53、上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

54、上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％或98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％或94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％或89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％或84％的同一性。

55、本发明采用天然信号肽ns，荧光素酶信号肽ga(seq id no.1)和抗体信号肽lc引导猴痘病毒b6r抗原真核细胞分泌表达。研究证明：荧光素酶信号肽ga实验组的猴痘病毒b6r抗原分泌表达量显著优于天然信号肽ns和抗体轻链信号肽lc实验组，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。本发明采用真核细胞分泌表达方式制备b6r蛋白胞外区，具有以下优势：1)分泌上清蛋白背景低，易于纯化；2)可溶性表达，避免形成包涵体；3)信号肽酶精准切割，n端无冗余met残基，产生符合预期的蛋白序列，本发明适用于疫苗开发中的抗原制备等应用。