一种用于蛋白高表达的细胞试剂的制作方法

本技术涉及生物领域，更具体的涉及一种用于蛋白高表达的细胞试剂。

背景技术：

1、乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，每年全世界约有130万人被诊断为乳腺癌，而有约40万人死于该病。近年来我国乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，在某些大城市已占女性恶性肿瘤的第一位。

2、her-2也称为c-erb2或her-2/neu，属于egf受体家庭成员。该家族有4个成员，分别为erb-b1、erb-b2、erb-b3和erb-b4。erb-b2由922个腺嘌呤、1382个胞嘧啶、1346个鸟嘌呤和880个胸腺嘧啶组成。原癌基因her-2位于染色体17q21，编码185kda具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体。由胞外结构域(ecd)、跨膜结构域和细胞内结构域(icd)三部分组成，胞外结合域主要是由2个配体结合域(rld)与2个富含半胱氨酸区构成。her-2基因的生物学功能迄今为止，尚未发现与其有高亲和力的特异性配体。但her-2rld可与egf受体家族的其他成员及配体形成复合物，参与细胞增殖信号的转导。her-2是egf受体家庭中表达更为广泛的受体，其过度表达的肿瘤细胞对化疗不敏感；它参与了抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞存活；上调血管内皮生长因子(vegf)/血管通透性因子(vpf)，促进肿瘤新生血管生成：增加肿瘤细胞的侵袭力，破坏机体组织抗侵袭屏障等。因此，her-2是肿瘤免疫治疗研究的一个重要靶分子。

3、p185蛋白是癌基因her-2编码的跨膜糖蛋白受体，相对分子量是185ku，具有酪氨酸激酶活性，p185蛋白被异常激活后发生自身磷酸化，并磷酸化其他底物，引起下游的信号传导，最终导致细胞的增殖乃至癌变。研究认为p185升高是一个比her-2扩增更有意义的生物学参数。p185蛋白主要是在人体的胚胎发育时期表达，它参与多种组织器官的生长发育。而在成人正常组织中此基因常以单拷贝存在，表达水平较低。在许多上皮来源游的信号传导，最终导致细胞的增殖乃至癌变。临床前研究发现，p185蛋白的高表达可提高乳腺癌细胞的转移潜能，表现出较多的侵袭性临床病理特征。

4、p185蛋白高表达可导致乳腺上皮细胞的恶性转化，增加肿瘤细胞的侵袭性，并对默写化疗药物耐药，因此，选择有效抑制her-2信号激活通路，有望成为肿瘤治疗和改善预后的重要方法。以her-2为靶点治疗的，历史上第一个生物基因靶向治疗药物曲妥珠单抗(transtuzumab)即赫赛汀(herceptin)己于1998年10月由美国fda正式批准上市。这是一种重组dna衍生的人源化(人鼠嵌合性)抗her-2单克隆抗体，对乳腺癌高表达患者有效。herceptin与her-2受体细胞外区域结合，具有高度亲合力和特异性，既能阻断her-2受体而产生抗肿瘤效应，又能与人体免疫细胞作用，产生抗体依赖性细胞毒(adcc)效应。比普通的放疗、化疗、激素治疗等方法好，靶向性生物基因疗法的作用机制在于可通过基因选择针对性的杀伤恶性肿瘤细胞，而不影响正常细胞的生存，这是一种具有突破意义的生物基因治疗方法。通过反义药物下调her-2的表达也有不少报道，还发现靶向her-2的反义药物ha824能够显著下调p185蛋白的表达并抑制p185蛋白高表达的乳腺癌细胞的生长，ha824还可以显著抑制akt的磷酸化。此外，有关酪氨酸激酶磷酸化的抑制剂的小分子化学药物的应用也是治疗肿瘤的新途径。

5、国内也有不少关于p185单克隆抗体的报道。cn1118568c中公开了一种抗p185neu/c-erbb-2单克隆抗体，其采用细胞表面表位包埋法免疫，即用neu/c-erbb-2转基因nih/3t3细胞t6-17经小鼠抗nih/3t3抗血清包埋后免疫小鼠；得到的抗p185neu/c-erbb-2单克隆抗体杂交瘤，所分泌的单抗其亚类都为igg1，都能专一性地与癌细胞膜上p185neu/c-erbb-2的膜外区结合，而与生长因子受体无交叉反应，与良性组织细胞也无反应；所得单抗结合特异性强，对人乳腺癌病理切片阳性染色为膜着色，背景低，可发展成诊断试剂盒用于临床检测肿瘤组织中p185neu/c-erbb-2的表达水平。cn105646704b公开了p185erbb2人鼠嵌合抗体chab26能诱导skov3凋亡，该抗体能大大地降低了鼠源单克隆抗体的免疫源性，从而能有效避免抗抗体反应发生；与制备药用重组蛋白的细胞培养或微生物发酵罐等传统技术相比，通过本发明所得转基因fvb小鼠生产药用重组蛋白具有产量高、成本低、活性高、易规模化、能缩短新药上市周期和市场潜力巨大等优点。目前，针对p185设计并制备相应的单克隆抗体已有不少报道，但是针对该靶点的研究还有待进一步的提高和完善。

技术实现思路

1、本发明针对乳腺癌的治疗方法，提供了一种可选择的治疗方法。

2、一方面，本发明提供了一种用于治疗p185高表达的乳腺癌的药物组合物。

3、具体的，所述的组合物中含有本发明的单克隆抗体。

4、具体的，所述单克隆抗体是特异性针对p185蛋白，该抗体的轻链可变区序列如seqid no：1所示，重链可变区序列如seq id no：2所示。

5、具体的，本发明的单克隆抗体还可以被制备成为用于治疗癌症的药物组合物。

6、所述的药物组合物含有合适的各种适合给药的组分。

7、具体的，本公开提供的药物组合物中还含有离子盐赋形剂或缓冲剂、蔗糖。在一些实施例中，所述离子盐赋形剂或缓冲剂可以是来自由以下组成的组的一种或多种组分：磷酸二氢钾、磷酸钾、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸钠六水合物、磷酸二氢钠一水合物、氨丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)

8、(tris-hcl)、氨基酸、组氨酸、组氨酸盐酸盐(组氨酸-hcl)、琥珀酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠以及4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、硫酸钠、硫酸镁、氯化镁6-水合物、硫酸钙、氯化钾、氯化钙、柠檬酸钙。

9、所述药物组合物的ph为6.0到8.8。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.0到9.0。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.0。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.1。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.2。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.3。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.4。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.5。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.6。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.7。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.8。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为6.9。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.0。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.1。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.2。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.3。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.4。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.5。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.6。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.7。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.8。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为7.9。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.0。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.1。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.2。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.3。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.4。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.5。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.6。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.7。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.8。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为8.9。在某些实施例中，所述药物组合物的ph为9.0。进一步的，本发明的药物组合物还包含第二抗癌试剂或化学治疗药物。

10、具体的，抗癌试剂和化学治疗药物的非限制性的实例可以包括这样的药物，例如但不限于：生物碱类例如但不限于：多西他赛、依托泊苷、伊立替康、紫杉醇、替尼泊苷、托泊替康、长春碱、长春新碱、长春地辛；烷化剂例如但不限于：白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、塞替派、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氧氮芥、美法仑、novemebichin、培磷酰胺苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫斯汀、卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露莫斯汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、替莫唑胺；抗生素和类似物例如但不限于：阿柔比星、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星、嗜癌霉素、色霉素(cromomycin)、更生霉素、柔红霉素、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、伊达比星、美诺立尔、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycine)、橄榄霉素、培洛霉素、吡柔比星、普卡霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物例如但不限于：二甲叶酸、伊达曲沙、甲氨蝶呤、吡曲克辛、蝶罗呤、雷替曲塞、三甲曲沙、克拉曲滨(cladridine)、氟达拉滨、6-巯嘌呤、喷司他丁硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、环胞苷、阿扎胞苷、6-氮脲苷、卡莫氟、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、乙嘧替氟、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、替加氟；铂络合物例如但不限于：卡铂、顺铂、米帕、奥沙利铂；烷化剂包括但不限于：白消安(马利兰、白舒非)、苯丁酸氮芥(留可然)、异环磷酰胺(含或不含mesna)、环磷酰胺(cytoxan、neosar)、普磷酰胺、美法仑、l-pam(爱克兰)、氮烯唑胺(dtic-dome)和替莫唑胺(temodar)；蒽环类抗生素包括但不限于：多柔比星(adriamycin、doxil、rubex)、米托蒽醌(novantrone)、伊达比星(idamycin)、戊柔比星(valstar)和表柔比星(ellence)；抗生素包括但不限于：更生霉素、放线菌素d(cosmegen)、博来霉素(blenoxane)、柔红霉素和道诺霉素(cerubidine、danuoxome)；芳香酶抑制剂包括但不限于：阿那曲唑(arimidex)和来曲唑(letroazole)(femara)；二膦酸盐包括但不限于：唑来膦酸(zometa)；环氧酶抑制剂包括但不限于塞来考昔(celebrex)；雌激素受体调节剂包括但不限于他莫西芬(nolvadex)和氟维司醇(faslodex)；叶酸酯拮抗剂包括但不限于甲氨蝶呤和三甲曲沙(tremetrexate)；无机三氧化二砷包括但不限于三氧化二砷(trisenox)；微管抑制剂(例如紫杉烷类)包括但不限于长春新碱(安克平)、长春碱(velban)、紫杉醇(taxol，paxene)、长春瑞滨(诺维本)、埃博霉素b或d或任一的衍生物和discodermolide或其衍生物，亚硝基脲包括但不限于丙卡巴肼(matulane)、洛莫司汀、ccnu(ceebu)、卡莫司汀(bcnu、bicnu、gliadelwafer)和雌莫司汀(emcyt)；核苷类似物包括但不限于巯嘌呤、6-mp(purinethol)、氟尿嘧啶、5-fu(adrucil)、硫鸟嘌呤、6-tg(硫鸟嘌呤)、羟基脲(hydrea)、阿糖胞苷(cytosar-u、depocyt)、氟尿苷(fudr)、氟达拉滨(fludara)、喷司他丁(nipent)、克拉曲滨(克拉立平，2-cda)、吉西他滨(gemzar)和卡培他滨(xeloda)；破骨细胞抑制剂包括但不限于帕米膦酸盐(aredia)；含铂化合物包括但不限于顺铂(platinol)和卡铂(paraplatin)；类视黄醇包括但不限于维甲酸、atra(vesanoid)、阿利维a酸(panretin)和贝沙罗汀(targretin)；拓扑异构酶1抑制剂包括但不限于托泊替康(hycamtin)和伊立替康(camptostar)；拓扑异构酶2抑制剂包括但不限于依托泊苷、vp-16(vepesid)、替尼泊苷、vm-26(vumon)和依托泊苷磷酸酯(etopophos)；酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于依马替尼(gleevec)；各种其它蛋白包括单克隆抗体、肽和酶，各种其它分子，如，例如，超氧化物歧化酶(sod)、来普汀；类黄酮；或其任何组合。

11、进一步的，本发明提供了特异性针对p185蛋白的单克隆抗体在制备p185高表达的乳腺癌的药物组合物中的用途，具体的所述的单克隆抗体抗体的轻链可变区序列如seq idno：1所示，重链可变区序列如seq id no：2所示。

12、有益效果

13、本发明依据现有技术中通过抑制p185蛋白的活性即可影响癌细胞生长的特性，特异性的制备并获得了针对p185的单克隆抗体，该抗体不仅具有较好的特异性和亲和特性，还能够有效的抑制癌细胞的增殖，可以制备成为药物。